四种钙信号蛋白及其在寄生虫学上的初步研究

王自文，韩红玉，黄 兵

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241）

·综述·

四种钙信号蛋白及其在寄生虫学上的初步研究

王自文，韩红玉，黄 兵

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海200241）

不同种类的寄生虫入侵宿主和入侵后在宿主体内生存的机制非常复杂，但是影响这两个过程的主要因素目前已逐渐被揭示。Ca2+是寄生虫体内的一种重要的金属离子，它影响着寄生虫的许多生理生化活动，如运动、信号转导、渗透压的维持等。而Ca2+信号蛋白则是Ca2+能够发挥重要作用的直接承担者，钙离子信号蛋白是直接可以与Ca2+结合的蛋白质，它被Ca2+激活以后又可以与下游和他具有相互作用的蛋白质结合，从而使寄生虫发挥相应的生理生化作用。对能够与Ca2+信号蛋白结合的蛋白进行研究，有助于研制抗寄生虫的新药物和生物制剂，因为它们可能是一种存在于寄生虫体内潜在的新药物受体和靶标，而只有Ca2+信号蛋白被Ca2+活化以后才可以对这一互作蛋白展开深入的研究。本文综述了在寄生虫体内存在的4种Ca2+信号蛋白的重要性质和作用机制，对开展寄生虫Ca2+信号蛋白及其下游的互作蛋白的研究提供了一个比较基础的材料。

Ca2+；信号蛋白；钙调素；钙网蛋白；钙依赖蛋白激酶；膜联蛋白

钙元素广泛存在于自然界和各种生物体内，而游离态的Ca2+更是在生命活动中扮演着极其重要的角色，它几乎参与了生命体所有的生理生化活动[1]。作为一种在细胞内以游离状态存在的信号分子，Ca2+是细胞增殖、分裂、运动、能量代谢、氧代谢、细胞膜通透性及稳定性、细胞的信息传递等生理功能正常发挥的物质基础，胞内Ca2+主要来源于胞内钙贮池释放、电压依赖性钙通道（voltage dependent calcium channel, VDC）及受体介导的胞外Ca2+进入胞内的这3个过程[2]。

目前，在人类以及其他哺乳动物中关于Ca2+的功能及其作用机制已经被研究的比较清楚，然而这方面的研究在一些低等生物中还没有展开。寄生虫是一种真核生物，无论是寄生在细胞内还是寄生在细胞外，其入侵和逸出细胞时，Ca2+都发挥着重要的作用。然而Ca2+发挥作用并不是直接进行，在一些顶复器门原虫当中，Ca2+通过结合下游的一些蛋白质或蛋白质类似物，使这些蛋白质活化导致细胞内产生一系列的级联放大反应，刺激虫体的一些细胞器（如微线体、致密斑和棒状体）分泌相关的蛋白质，从而形成带虫空泡而入侵或逸出宿主细胞[3-5]。对于Ca2+在细胞内结合的信号蛋白质即钙信号蛋白（calcium signaling protein，CSP），目前已经在高等生物中有比较清楚的研究，例如钙调素（calmodulin，CaM）、钙网织蛋白（Calreticulin，CRT）、钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）以及膜联蛋白（annexin）等[6]，他们具有很明显的物种特异性和时期表达差异性。本文对这4种Ca2+信号蛋白的特性及在寄生虫学上的研究现状进行综述，为深入开展寄生虫Ca2+信号蛋白的相关研究提供基础材料。

1 钙调素（CaM）

1.1 钙调素的结构和功能CaM是一种Ca2+受体，其活性受Ca2+调控。Gehrig等[7]最先对Ca2+-CaM复合体结构进行了研究，获得了Ca2+-CaM-TFP的蛋白晶体及由此晶体获得的部分X光衍射数据。随后，Babu等[8]首次用X光衍射得到大鼠Ca2+-CaM在分辨率为0.13 nm的空间结构，并报道了该蛋白在分辨率为0.122 nm的结构。在分辨率为0.13 nm时，能看到多肽链走向，可在一级结构帮助下推测氨基酸种类，但不能分辨氨基酸的侧链及多肽链的整个构象。从该结构中发现CaM分子为哑铃形结构，N端及C端为两个球形结构域，由中央28个氨基酸构成的螺旋区连接，整个分子总长度为615 nm，包括7段α螺旋（α-helix），在N端和C端分别含有2个loop区，由这4个loop区与位于两头部的6个α-helix共形成4个典型的helix-loop-helix EF手形结构即Ca2+结合区，并各结合1个Ca2+，另外由不相邻的12个氨基酸残基分别在N端及C端形成一个loop区，并与两个α-helix相连接。在N端和C端的2个Ca2+结合区之间分别构成1对短的反平行β折叠片（antiparallel beta-sheets），在N端和C端每一半分子中均含有一个疏水穴（hydrophobic cleft），每一疏水穴面积为1.00 nm×1.25 nm，深度0.95 nm，由一级结构不连续的14个氨基酸残基构成，这两个疏水穴与中心螺旋共同负责与靶酶及拮抗剂结合[9,10]。众所周知，生物体内的cAMP、cGMP是第二信使，但Ca2+作为信使的作用更大。CaM的主要作用是调节环核苷酸的代谢水平，CaM通过对磷酸二酯酶（PDE）及腺苷酸环化酶的作用来调节cAMP和cGMP，PDE是第二个已知受CaM激活的酶，它存在于细胞的颗粒和可溶部分，其功能是分解cAMP及cGMP。CaM调节细胞中的Ca2+浓度，Ca2+-CaM是膜上钙泵（Ca2+-Mg2+-ATPase）激活剂。一切细胞皆由钙泵维持胞内低钙水平，以防难溶性磷酸钙盐形成。CaM调节细胞收缩以及收缩时的能量供应，使供能与收缩协调，因此它可很好的调节糖原代谢，CaM还调节神经递质合成与释放以及受精过程、有丝分裂和微管解聚[11]。

1.2 钙调素在生物体中的分布以及作用机制CaM广泛分布于几乎所有真核生物中，在哺乳动物各种组织以及蛙卵、章鱼、海胆卵、蚯蚓、扇贝、海葵、海覃、藻类、霉菌、粘菌、四膜虫、大麦、小麦、人参、大豆、菠菜中均分离出CaM或者类CaM蛋白[12]。CaM作用机制归类为2个方面：Ca2+-CaM复合物直接与下游靶酶结合，如PDE、磷酸化激酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、环化酶等，使这些酶活化；通过依赖Ca2+-CaM的蛋白激酶，使靶酶磷酸化产生效应，已知依赖CaM的蛋白激酶有磷酸化酶激酶、糖元合成酶激酶、肌球蛋白轻链激酶、60 K蛋白激酶、微管蛋白激酶、酪蛋白激酶、髓鞘碱性蛋白激酶、色氨酸单加氧酶激酶、酪氨酸单加氧酶激酶、乙酞胆碱受体激酶等[11]。

1.3 钙调素在寄生虫中所起的作用在锥虫(Trypanosoma)细胞活动中，CaM基因是调控细胞内Ca2+代谢的关键基因[13]。而在利什曼原虫（Leishmania）中，CaM可以有效地对肌球蛋白XXI内聚化、运动性以及脂质的连接性进行调控，在利什曼原虫缺乏CaM的情况下，交连肌动蛋白微丝就会形成。交连肌动蛋白微丝是一种不能运动的二聚体，对这种二聚体的结构进行分析，发现二聚体结构域的颈部包含有1个CaM结合区域，这个区域是肌球蛋白产生力量和运动的关键区域，也可能是寄生虫体内脂质运输的载体，也就是说CaM与此区域结合可以防止利什曼原虫肌球蛋白二聚体的形成[14]。Zhou等[15]研究发现CaM在华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）的发育和生长过程、Ca2+吸收以及营养物质的运输和虫卵形成过程中起着重要的作用，且呈现出阶段特异性表达，在华支睾吸虫的虫卵阶段CaM呈高表达，免疫化学荧光定位分析CaM存在于华支睾吸虫的外被皮、肠道、咽以及虫卵之中，因此，CaM对于华支睾吸虫这些器官的形成和功能的正常执行具有很大影响。

2 钙网织蛋白（CRT）

2.1 钙网织蛋白的结构和功能CRT是内质网/肌浆网主要的一种可溶性Ca2+结合蛋白，由Ostwald和MacLennan[16]在1974年首次从骨骼肌肌浆网中提纯得到。CRT属KDEL（内质网滞留信号四肽序列）蛋白家族，存在于高等生物除红细胞以外所有细胞中，分子量46 kDa，包含N-、P-、C-3个结构域。在N结构域N末端为高度折叠的球状结构，其氨基酸序列最保守；Cys120和Cys146形成二硫键，结合ATP或Zn2+发生构象改变，调节CRT与未折叠蛋白的结合能力；4个His残基中，His153与CRT功能密切相关，点突变后抑制InsP3（Inositol 1，4，5-trisphosphate）-Ca2+通道活化[17]。N结构域还与糖皮质激素受体DNA结合域[18]、α-整合素[19]相互作用，抑制PDI分子伴侣功能，增加ERp57活性；P结构域富含Pro，有A、B两套重复序列，对于CRT的Ca2+高亲和力和凝集素样分子伴侣活性非常重要，P结构域的氨基酸序列与其他Ca2+依赖性分子伴侣如钙联蛋白（Calnexin）、钙镁蛋白（Calmegin）等相似，可与PDI及细胞毒性T细胞颗粒组分穿孔素（Perforin）相互作用[20]。CRT的C结构域与肌浆网的Ca2+结合蛋白—集钙蛋白（Calsequestrin）结构相似，呈强酸性，末端有KDEL序列，可靶向性引导CRT定位于内质网，该区域有较高的Ca2+结合容量，可调节其与PDI、ERp57等分子伴侣的相互作用[16,21]。CRT功能主要有分子伴侣作用[22-24]，调节细胞内钙浓度[25]和影响血管生成[26]。此外，CRT还有参与信号传导和细胞粘附，调节基因表达，促进生殖细胞和心脏发育，抗血栓等功能[27,28]。

2.2 钙网织蛋白在细胞中的分布以及作用机制CRT主要存在于真核生物中，在非肌细胞粗面内质网外，细胞核和核膜中均发现，最近研究表明它还存在于细胞毒性T细胞胞浆颗粒[20]。Chiran等[29]报道e-CRT通过GPI-锚定结合分子CD59连接在PMN细胞表面，补体C1q的胶原尾与e-CRT结合，影响细胞膜Ca2+内流。CRT作用机制包括4个方面[30]：首先是胞浆定位CRT的转位；其次是磷脂酸丝氨酸外化介导的细胞膜表面CRT转位，细胞表面CRT的转运与胞浆定位的CRT有关；接下来是细胞膜表面CRT通过分泌途径的转位，细胞膜外CRT可能通过膜泡运输方式进行转位；最后是CRT与伴侣分子共转位。在胞浆定位CRT的转位中，Shaffer等[31]报道，胞浆CRT库（也称微库）沿ER分布，调节一系列糖皮质激素表达。Holaska等[32]研究发现，胞核中的CRT与含有核转运信号（NES）的蛋白发生相互作用，从而一同被转移至胞浆，该机制称为“逆向转位”。CRT胞浆定位机制：CRT靶向定位于ER的过程并非十分有效，可能有CRT遗漏在胞浆；CRT定位于ER的信号肽被剪切掉从而失去ER驻留能力[30]。存在于高尔基体中的CRT可能与其伴侣分子（如α-integrin和MHC-I）相关联从而一同转位至细胞表面[33]。ERp57是CRT转位关键伴随分子，与CRT有直接相互作用，以shRNA敲除ERp57后，CRT转位至细胞表面的能力被明显抑制并失去抗肿瘤作用，外源添加重组CRT蛋白则恢复该作用[34]。

2.3 钙网织蛋白在寄生虫中所起的作用克氏锥虫（Trypanosoma cruzi，Tc）分泌的CRT可以抑制宿主的凝集素信号通路，从而逃逸宿主机体本身对虫体的杀死作用，达到使虫体在宿主体内能够幸存的效果。其机制主要是TcCRT可以与宿主的L-Ficolin结合，使其功能减弱，从而抑制宿主体内补体激活的经典途径[35]。尽管寄生虫与人之间的进化距离比较遥远，但是寄生虫的CRT与人类的CRT（HumanCRT，HuCRT）有50%的序列同源性，而在一些关键的功能结构域中它们的相同性则为80%，对多种寄生虫CRT的同源性进行鉴定后发现，在寄生虫适应自己所处的环境时CRT都会产生作用，而且这种作用比较保守，在克氏锥虫与宿主的内皮细胞发生相互作用时，TcCRT能够抗肿瘤的生长[36]。Debrabant等[37]认为利什曼原虫分泌的蛋白对于它在所要寄生的媒介昆虫和哺乳动物宿主细胞中的生存至关重要，然而CRT对于利什曼原虫分泌这些相关蛋白质具有很大的影响，同时CRT也决定着利什曼原虫自身的毒力强弱。

3 钙依赖蛋白激酶（CDPKs）

3.1 钙依赖蛋白激酶的结构和功能CDPKs是钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶或类似钙调素结构域的蛋白激酶（calmodulin-like domain protein kinases），由多基因编码的大家族。拟南芥基因组有34个CDPKs基因，水稻基因组有29个CDPKs基因[38]。CDPKs为单肽链，具有明显的结构特征，从N端到C端有4个功能区，依次是可变区、催化区、连接区和调控区[39]。N末端的可变区长短不一，很少有同源性；催化区有典型的Ser/Thr蛋白激酶催化保守序列；同源性较高连接区在各类功能区中最保守，富含碱性氨基酸，紧靠催化区以拟底物方式与催化区结合起自抑制作用，所以该区又称自抑制区；调控区是钙结合区，也是CDPKs有别于其它类型激酶的特有区域，保守性最差，调控区有一段结构和功能类似于CaM的氨基酸序列，一般共有4个与Ca2+结合的EF手性结构，这是CDPKs对Ca2+高度亲和而不依赖于CaM的原因[38]。认识CDPKs底物可推知其功能，迄今发现的CDPKs底物包括代谢酶类（如蔗糖合成酶、PEP梭化酶、亚硝酸还原酶等）、胁迫相关蛋白（如PAL）、抗菌蛋白（如马铃薯梭肤酶抑制剂、磷脂转移蛋白、植保素等）、离子通道蛋白（如ACAZ、KATl、H+-ATpase等）、其他蛋白（如热稳定蛋白）等[40]。真菌激发子可引起质膜H+-ATPase磷酸化状态改变，接种真菌激发子2 h后，发现脱磷酸化的H+-ATPase被CDPK重新磷酸化[40]。许多离子的运输受CDPK调节，如质膜H+-ATPase[41,42]、磷酸肌醇4激酶[43]、质膜内向K+通道等[44-45]。

3.2 钙依赖蛋白激酶在生物体中的分布以及作用机制CDPKs存在于植物[46]、绿藻[47]，且在植物体内分布广泛，但在细菌、真菌、酵母、线虫和脊椎动物中尚未发现[48]。CDPKs通过对Ca2+信号传递过程的下游蛋白磷酸化而产生磷酸化级联放大效应，就是通过这种不断向下游传递的磷酸化信号，使相关蛋白质发挥功能。Ca2+与CDPKs结合以后，CDPKs被激活从而与其下游的特异性底物结合，底物磷酸化刺激亚细胞结构分泌一些蛋白质，这些蛋白质逸出细胞后发挥作用。同时CDPKs本身也存在磷酸化位点，在许多CDPKs中已经发现分子内自磷酸化现象的存在，CDPKs活性除了受Ca2+和磷酸化调节，还受14-3-3蛋白、脂类等物质的调节[38]。

3.3 钙依赖蛋白激酶在寄生虫中所起的作用作为Ca2+信号蛋白的CDPKs向下游所传递的信号在顶复门寄生虫中具有多重作用。在刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，Tg）中，TgCDPKs家族的蛋白质可以促进虫体顶部微线体蛋白质的分泌，而这种蛋白在刚地弓形虫入侵宿主细胞时是必需的[49,50]。在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）中，通过序列比对发现PfCDPKs家族有7个CDPK基因，PfCDPK1具有促进恶性疟原虫的运动性和入侵细胞的作用，并且PfCDPK1对于恶性疟原虫在宿主血液中的发育也极其重要，而Ca2+对恶性疟原虫的配子发育过程有直接影响，PfCDPK3和PfCDPK4是Ca2+在恶性疟原虫配子发育过程的中介，PfCDPK5参与了恶性疟原虫从红细胞逸出的过程[51]。在柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella, Et）中，用Real-time quantitative PCR检测EtCDPK3基因的表达，结果表明在柔嫩艾美耳球虫的子孢子阶段EtCDPK3基因高表达，子孢子阶段是柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞最主要的一个阶段，因此EtCDPK3蛋白对于虫体入侵和逸出宿主细胞具有推动作用[52]。总之，CDPKs家族的蛋白质能够影响顶复门原虫一系列的生理生化活动，促进顶复门原虫致密斑、微线、棒状体蛋白的分泌，使虫体的运动性加强，入侵宿主细胞能力增强，从而更加适应宿主细胞的环境[53]。

4 膜联蛋白（Annexin）

4.1 膜联蛋白的结构与功能Annexin是一类依赖Ca2+的磷脂结合蛋白家族，Annexin最早发现于1978年，由Creutz等[54]分离纯化。从第一个被克隆的人AnnexinA1和A2以来，迄今为止已经发现超过103个Annexin亚家族成员，这些Annexin分布在动植物各种组织和细胞中[55]。Annexin在进化上较保守，多数Annexin是胞内蛋白。Annexin在胞内以游离形式存在，也可与细胞膜或细胞骨架结合[56-58]。Annexin具备与Ca2+结合的能力，因此Annexin能参与一系列依赖于Ca2+的生物学活动[59]。依照基因结构、进化关系以及染色体上的定位不同，Annexin 分5类：A类为脊椎动物Annexin、B类为无脊椎动物Annexin、C类为真菌和单细胞真核生物Annexin、D类为植物Annexin、E类为原生生物Annexin[60]。Annexin家族由超过500种基因编码，其蛋白结构具有极高相似性，每个Annexin含2个主要区：多样的N端和保守的C端，保守C端一般有4个Annexin重复序列（AnnexinA6含有8个），每个重复序列由大约70个高度保守的氨基酸残基构成，每一重复序列形成由5个α-helix堆叠成的致密圆盘状，该结构域有结合Ca2+的能力，是Annexins家族成员的核心区域，与Ca2+结合后，此结构域再与带负电荷的磷脂分子极性头部结合；N端结构域也称尾区，包括蛋白水解位点、磷酸化位点和其他蛋白结合位点，是Annexins分子的功能调节区[61,62]。作为一种膜磷脂结合蛋白，Annexin参与了与生物膜结构和功能有关的多种生命活动，如生物膜结构稳定性、吞噬囊泡形成、Ca2+代谢及其离子转运，并与细胞骨架相互作用参与细胞的有丝分裂[63]。Annexin参与细胞膜之间紧密连接的形成[64]，X射线晶体学、电泳分析和同源模建结果表明，某些Annexin直接作用于Ca2+通道，特别是Annexin I、Annexin V、Annexin VI 和Annexin VII都参与细胞电压门控Ca2+通道的活动[65]。

4.2 膜联蛋白在生物体中的分布以及作用机制Annexin在自然界分布广泛，无论是脊椎动物还是无脊椎动物、植物、真菌和单细胞真核生物、原生动物中均有发现。Annexin的作用机制是当Annexin与Ca2+结合后，N端结构会改变，这种改变使Annexin能与一种叫做S100A10的蛋白发生特异性结合，2个Annexin-S100A10蛋白复合体结合形成异四聚体蛋白，凭借这种结合作用使细胞膜之间的距离不断被拉近，膜脂相互融合形成囊泡[66,67]。随后Annexin磷酸化，导致Annexin的N端区域非常容易受到蛋白水解酶攻击, 蛋白水解释放S100A10二聚体，细胞膜裂解，囊泡被释放出来[68]。

4.3 膜联蛋白在寄生虫中所起的作用Annexin家族成员目前只有很少一部分被研究清楚。利什曼原虫的前鞭毛体中缺乏磷脂酰丝氨酸，但它前鞭毛体的AnnexinⅤ可结合磷脂酸，功能等效于磷脂酰丝氨酸，因此利什曼原虫的前鞭毛体能发挥正常作用[69]。Annexin B30是华支睾吸虫的一种分泌性蛋白质，对Annexin B30的研究有助于了解华支睾吸虫的致病机制。目前CsANXB30已被分离出来，Real-time PCR表明CsANXB30在华支睾吸虫囊蚴阶段高表达，CsANXB30一般存在于虫体外表皮、肠道和成虫卵以及囊蚴表皮和卵黄腺中，其Ca2+结合部位一旦与Ca2+结合就会具有结合磷脂的能力。He等[70]称Annexin B30参与虫体与宿主间的相互作用并且能影响被感染宿主的自身免疫反应，在体外发现牛血吸虫（Schistosoma bovis）的Annexins具有溶解纤维蛋白和作为抗凝剂的作用，曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）的Annexin 2参与外表皮全部发育过程。Borges等[71]称在间日疟原虫（Plasmodium vivax）中Annexin-A1能够调控宿主的免疫应答。Hongsrichan等[72]称在麝猫后睾吸虫（Opisthorchis viverrini）中分泌的Annexin A1 （ANXA1）具有控制抗炎症信号释放，信号转导过程中激酶的活化，自身细胞骨架和细胞外基质完整性的维持，组织发育和细胞凋亡以及变异的能力，所以ANXA1在虫体与宿主动态相互作用中起纽带作用。因此，Annexin家族成员对寄生虫生理生化活动具有很大的影响。寄生虫Annexin不仅参与了维持其自身细胞结构的完整性，而且能够调节宿主的免疫应答反应，从而为自己营造一个适宜的生存坏境，同时Annexin也是一个今后抗寄生虫药物研究的新靶标[73,74]。

5 展望

Ca2+对于生物体的生命活动至关重要，它与生命体的新陈代谢活动息息相关，然而隐藏在Ca2+背后的钙信号蛋白则是Ca2+能够正常发挥作用的基础，所以对于Ca2+信号蛋白的认识是更进一步去了解Ca2+功能的有效途径。对于寄生虫来说，钙信号蛋白能够有助于它进入宿主和入侵宿主细胞，如果有一种理想的Ca2+阻断剂，则可以有效地控制寄生虫病，但这是不现实的。因此，可以把控制寄生虫病的研究方向聚焦在Ca2+下游的钙信号蛋白上。如钙依赖蛋白激酶，它仅仅存在于顶复门原虫和植物中，在其他的哺乳动物中没有发现。在弓形虫和疟原虫中对于钙依赖蛋白激酶的研究已经很成熟了，而在球虫上这方面的研究还不是很多，由于这一激酶天然的特异性和独特的功能，它可能成为一个较好的药物结合或者阻断的靶标，将为球虫病的防治研究提供新的方向。

对于蛋白质相互作用的研究技术目前已经很成熟，如酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术（Co-IP）、GST Pull-down技术、荧光共振能量转移、Far-western技术等，运用这些技术可以准确的筛选和分离出与寄生虫相关的Ca2+信号蛋白的下游作用底物或者相关的结合因子，对这些底物或者相关因子进行结构和功能的研究，只要破坏底物的结构就可以达到阻断整个钙信号蛋白介导的入侵信号通路，间接的通过阻断钙信号蛋白的功能来抑制寄生虫对宿主的入侵或者逃逸过程，从而降低寄生虫病的发生概率，所以寄生虫的Ca2+信号蛋白是研制新型抗寄生虫药物和生物制剂的良好靶标和潜在位点。

[1] Berridge M J, Lipp P, Bootman M D.The versatility and universality of calcium signalling[J].Nat Rev Mol Cell Biol, 2000, 1(1)∶ 11-21.

[2] 黄俊, 梁志民.细胞内Ca2+研究进展[J].医学文选, 2000, 19(5)∶ 790-791.

[3] Dubremetz J F, Garcra-reguet N, Fourmaux M N, et al.Apical organelles and host cell invasion by Apicomplexa[J].Int J Parasitol, 1998, 28(7)∶ 1007-1013.

[4] Etzold M, Lendner M, Daugschies A, et al.CDPKs of Cryptosporidium parvum—stage-specific expression in vitro[J].Parasitol Res, 2014, 113(7)∶ 2525-2533.

[5] 韩红玉, 林矫矫, 黄兵.鸡球虫入侵相关分子的研究进展[J].动物医学进展, 2007, 28(9)∶ 60-64.

[6] 张娜, 尚忠林.植物细胞中的膜联蛋白(annexin)[J].植物生理学通讯, 2010, 46(3)∶ 277-283.

[7] Gehrig L M, Delbaere L T, Hickie R A.Preliminary X-ray data for the calmodulin/trifluoperazine complex[J].J Mol Biol, 1984, 177(3)∶ 559-561.

[8] Babu Y S, Sack J S, Greenhough J J, et al.Threedemensional structure of calmodulin[J].Nature, 1985, 315(6014)∶ 37-40.

[9] Zielinski R E.Calmodulin and calmodulin-binding proteins in plants[J].Annu Rev Plant Biol, 1998, 49(1)∶697-725.

[10] Reddy A S N, Day I S, Narasimhulu S B, et al.Isolation and characterization of a novel calmodulin-binding protein from potato[J].J Biol Chem, 2002, 277(6)∶ 4206-4214.

[11] 顾永清.钙调素的生理功能[J].生物学通报, 1994, 29(10)∶12-14转17.

[12] 陈龙.钙调素的分布与功能[J].周口师专学报, 1994, 11(1)∶55-58转72.

[13] Miranda A, Samudio F, Saldaña A, et al.The calmodulin intergenic spacer as molecular target for characterization of Leishmania species[J].Parasit Vectors, 2014, 7(35)∶1-9.

[14] Batters C, Ellrich H, Helbig C, et al.Calmodulin regulates dimerization, motility,and lipid binding of Leishmania myosin XXI[J].Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(2)∶E227-E236.

[15] Zhou J, Sun J, Huang Y, et al.Molecular identification, immunolocalization, and characterization of Clonorchis sinensis calmodulin[J].Parasitol Res, 2013, 112(4)∶1709-1717.

[16] 徐菲菲, 刘秀华.钙网蛋白的生理及病理生理学作用[J].生理科学进展, 2006, 37(3)∶ 216-220.

[17] Guo L, Groenedyk J, Papp S, et al.Indentification of an N-domain histidine essential for chaperone function in calreticulin[J].J Biol Chem, 2003, 278(50), 50645-50653.

[18] Michalak M, Burns K, Andrin C, et al.Endoplasmi creticulum form of calreticulin modulates glucocorticoidsensitive gene expression[J].J Biol Chem, 1996, 271(46), 29436-29445.

[19] Coppolino M G, Woodside M J, Dem aurex N, et al.Calreticulin is essential for integrin-mediated calcium signalling and cell adhesion[J].Nature, 1997, 386(6627)∶843-847.

[20] Andrin C, Pinkoski M J, Burns K, et al.Interaction between a Ca2+-binding protein calreticulin and perforin, a component of the cytotoic T-cell granules[J].Biochemistry, 1998, 37(29), 10386-10394

[21] 夏燕, 王艳林.钙网蛋白的生物学特点及在肿瘤免疫治疗中的应用[J].山东医药, 2012, 52(23)∶ 85-86转89.

[22] Helenius A, Aebi M.Role of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum[J].Annu Rev Biochem, 2004, 73(1)∶ 1019-1049.

[23] Yoshiro S, Yoshito I.Calreticulin functions in vitro as a molecular chaperone for both glycosylated and nonglycosylated proteins[J].EMBO J, 1999, 18(23)∶ 6718-6729.

[24] Stevens F J, Argon Y.Protein folding in the ER[J].Semin Cell Dev Biol, 1999, 10(5)∶ 443-454.

[25] Wen X, Frank J L, Mary R W, et al.CRT modulates capacitative Ca2+influx by controlling the extent of inositol 1, 4, 5-Trisphosphate- induced Ca2+store depletion[J].J Biol Chem, 2000, 275(47)∶ 36676-36682.

[26] Yao L, Pike S E, Tosato G, et al.Laminin binding to the calreticulin fragment vasostatin regulates endothelial cell function[J].J Leukoc Biol, 2002, 71(1)∶ 47-53.

[27] 汤晓燕.钙网蛋白的生物学功能及其与自身免疫疾病的关系[J].国外医学(免疫学分册), 2005, 28(4)∶ 230-233.

[28] Steven J, Marek M, Michal O, et al.The ins and outs of Calreticulin∶ from the ER lumen to the extrcellular space[J].Trends Cell Biol, 2001, 11(3)∶ 122-129.

[29] Ghiran I, Klickstein L B, Nicholson-Weller A.Calreticulin is at the surface of circulating neutrophils and uses CD59 as an adaptor molecule[J].J Biol Chem, 2003, 278(23), 21024-21031.

[30] Jalali S, Aghasi M, Yeganeh B, et al.Calreticulin regulates insulin receptor expression and its downstream PI3 kinase/akt signalling pathway[J].Biochim Biophys Acta, 2008, 1783(12), 2344-2351.

[31] Shaffer K L, Sharma A, Snapp E L, et al.Regulation of protein compartmentalization expands the diversity of protein function[J].Dev Cell, 2005, 9(4)∶ 545-554.

[32] Holaska J M, Black B E, Love D C, et al.Calreticulin is a receptor for nuclear export[J].J Cell Biol, 2001, 152(1)∶127-140.

[33] 王晓礽, 刘秀华.非内质网钙网蛋白的生物学作用及其机制[J].生理科学进展, 2012, 43(1)∶ 29-33.

[34] Tufi R, Panaretakis T, Bianchi K, et al.Reduction of endoplasmic reticulum Ca2+levels favors plasma membrane surface exposure of calreticulin[J].Cell Death Differ, 2007, 15(2)∶ 274-282.

[35] Sosoniuk E, Vallejos G, Kenawy H, et al.Trypanosoma cruzi calreticulin inhibits the complement lectin pathway activation by direct interaction with l-Ficolin[J].Mol Immunol, 2014, 65(1)∶ 80-85.

[36] Ferreira V, Molina M C, Valck C, et al.Role of calreticulin from parasites in its interaction with vertebrate hosts[J].Mol Immunol, 2004, 40(17)∶ 1279-1291.

[37] Debrabant A, Lee N, Pogue G P, et al.Expression of calreticulin P-domain results in impairment of secretory pathway in Leishmania donovani and reduced parasite survival in macrophages[J].Int J Parasitol, 2002, 32(11)∶1423-1434.

[38] 万丙良.水稻CDPKs基因的表达及其功能研究[D].武汉∶华中农业大学, 2007.

[39] Harper J F, Sussman M R, Schaller G E, et al.A calciumdependent protein kinase with regulatory domain similar to calmodium[J].Science, 1991, 252(5008)∶ 951-954.

[40] Xing T, Higgins V J, Blumwald E.Regulation of plant defense response to fungal pathogens∶ two types of protein kinase in the reversible phosphorylation of the host plasma membrane H+-ATPase[J].Plant Cell, 1996, 8(3)∶ 555-564.

[41] Camoni L, FulloneM R, Marra M, et al.The plasma membrane H+-ATPase frommaize roots is phosphorylated in the C- terminal domain by a calcium-dependent protein kinase[J].Physiol Plant, 1998, 104(4)∶ 549-555.

[42] Schaller G E, Sussman M R.Phosphorylation of the plasma-membrane H+-ATPase of oat roots by a calciumstimulated protein kinase[J].Planta, 1988, 173(4)∶ 509-518.

[43] Yang W, Boss W F.Regulation of phosphatidylinositol 4-kinase by the protein activator PIK-A49[J].J Biol Chem, 1994, 269(5)∶ 3852-3857.

[44] 陈硕, 陈珈.植物中钙依赖蛋白激酶(CDPKs)的结构与功能[J].植物学通报, 2001, 18(2)∶ 143-148.

[45] Li J, Lee Y R, Assmann S M.Guard cells possess a calcium-dependent protein kinase that phosphorylatesthe KAT1 potassium channel[J].Plant Physiol, 1998, 116(2)∶785-795.

[46] Roberts D M, Harmon A C.Calcium-modulated proteins∶targets of intracellular calcium signals in higher plants[J].Annu Rev Plant Biol, 1992, 43(1)∶ 375-414.

[47] Yuasa T, Muto S.Ca2+-dependent protein kinase from the halotolerant green alga dunaliella tertiolecta∶ partial purification and Ca2+-dependent association of the enzyme to the microsomes[J].Arch Biochem Biophys, 1992, 296(1)∶ 175-182.

[48] 畅文君.番茄钙依赖性蛋白激酶的生化鉴定和功能分析[D].海口∶ 海南大学, 2010.

[49] 陶青, 赵俊龙.钙离子信号通路及相关蛋白激酶对弓形虫的作用[J].中国人兽共患病学报, 2011, 27(11)∶ 1041-1043.

[50] Nagamune K, Beatty W L, Sibley L D.Artemisinin induces calcium-dependent protein secretion in the protozoan parasite Toxoplasma gondii[J].Eukaryot Cell, 2007, 6(11)∶ 2147-2156.

[51] Lauciello L, Kappes B, Scapozza L, et al.Expression, purification and biochemical characterization of recombinant Ca-dependent protein kinase 2 of the malaria parasite Plasmodium falciparum[J].Protein Expr Purif, 2013, 90(2)∶ 170-177.

[52] Han H Y, Zhu S H, Jiang L L, et al.Molecular characterization and analysis of a novel calciumdependent protein kinase from Eimeria tenella[J].Parasitology, 2013, 140(6)∶ 746-755.

[53] Billker O, Lourido S, Sibley L D.Calcium-dependent signaling and kinases in apicomplexan parasites[J].Cell Host Microbe, 2009, 5(6)∶ 612-622.

[54] Creutz C E, Pazoles C, Pollard H B.Identification and purification of an adrenal medullary protein(synexin) that causes calcium-dependent aggregation of isolated chromaffin granules[J].J Biol Chem, 1978, 253(8)∶ 2858-2866.

[55] Huang K S, Wallner B P, Mattaliano R J, et al.Two human 35kD inhibitors of phospholipase A2 are related to substrates of pp60v-srcand of the epidermal growth factor receptor/kinase[J].Cell, 1986, 46(2)∶ 191-199.

[56] Mortimer J C, Laohavisit A, Macpherson N, et al.Annexins∶ multifunctional components of growth and adaptation[J].J Exp Bot, 2008, 59(3)∶ 533-544.

[57] Chander A, Chen X L, Naidu D G.A role for diacylglycerol in annexin A7-mediated fusion of lung lamellar bodies[J].Biochim Biophys Acta, 2007, 1771(10)∶ 1308-1318.

[58] Hofmann A.Annexins in the plant kingdom∶ perspective and potentials[J].Annexins, 2004, 1(1)∶ 51-61.

[59] 黄逸群, 左开井.膜联蛋白的功能与调控研究进展[J].生物技术进展, 2012, 2(3)∶ 157-164.

[60] Moss S E, Morgan R O.The annexins[J].Genome Biol, 2004, 5(4)∶ 1-8.

[61] Gerke V, Moss S E.Annexins∶ from structure to function[J].Physiol Rev, 2002, 82(2)∶ 331-371.

[62] Seaton B A, Dedman J R.Annexins[J].Biometals, 1998, 11(4)∶ 399-404.

[63] Rescher U, Gerke V.Annexins-unique membrane binding proteins with diverse functions[J].J Cell Sci, 2004, 117(13)∶ 2631-2639.

[64] Lee S M, Lee E J, Yang E J, et al.Identification of annexins, calcium-dependent membrane binding proteins that mediate osmotic stress and abscisic acid signal transduction in Arabidopsis[J].Plant Cell, 2004, 16(6)∶1378-1391.

[65] Pollard H B, Guy H R, Arispe N, et al.Calcium channel and membrane fusion activity of synexin and other membranes of annexin gene family[J].Biophys J, 1992,62(1)∶ 15-18.

[66] Bevers E M, Janssen M P, Willems G M, et al.No evidence for enhanced thrombin formation through displacement of annexin V by antiphospholipid antibodie[J].J Thromb Haemost, 2000, 83(5)∶ 792-794.

[67] Rety S, Sopkova J, Renouard M, et al.The crystal structure of a complex of p11 with the annexin II N-terminal peptide[J].Nat Struct Biol, 1999, 6(1)∶ 89-95.

[68] Futter C E, Felder S, Schlessinger J, et al.Annexin I is phosphorylated in the multivesicular body during the processing of the epidermal growth factor receptor[J].J Cell Biol, 1993, 120(1)∶ 77-83.

[69] Weingärtner A, Kemmer G, Müller F D, et al.Leishmania promastigotes lack phosphatidylserine but bind annexin V upon permeabilization or miltefosine treatment[J].PloS One, 2012, 7(8)∶ e42070.

[70] He L, Ren M, Chen X, et al.Biochemical and immunological characterization of annexin B30 from Clonorchis sinensis excretory/secretory products[J].Parasitol Res, 2014, 113(7)∶ 2743-2755.

[71] Borges Q I, Fontes C J, Damazo A S.Analysis of lymphocytes in patients with Plasmodium vivax malaria and its relation to the annexin-A1 and IL-10[J].Malar J, 2013, 12(455)∶ 1-7.

[72] Hongsrichan N, Intuyod K, Pinlaor P, et al.Cytokine/ Chemokine secretion and proteomic identification of upregulated annexin A1 from peripheral blood mononuclear cells cocultured with the liver fluke Opisthorchis viverrini[J].Infect Immun, 2014, 82(5)∶2135-2147.

[73] Cantacessi C, Seddon J M, Miller T L, et al.A genomewide analysis of annexins from parasitic organisms and their vectors[J].Sci Rep, 2013, 3∶ 2893.

[74] Jenikova G, Hruz P, Andersson M K, et al.α1-giardin based live heterologous vaccine protects against Giardia lamblia infection in a murine model[J].Vaccine, 2011, 29(51)∶ 9529-9537.

FOUR CALCIUM SIGNALING PROTEINS AND THEIR PRELIMINARY STUDIES IN PARASITOLOGY

WANG Zi-wen, HAN Hong-yu, HUANG Bing

(Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The invasion of a variety of parasites to hosts and their survival mechanisms in hosts are extremely complicated.However, the main elements that have an impact on these two processes have been revealed gradually.Calcium ion is a kind of important metal ions in parasites and infl uences a lot of physiological and biochemical activities, such as sports, signal transduction and osmotic pressure maintenance.Calcium ion signaling protein plays a key role by directly binding with calcium ion and interacting with other proteins on the downstream.As a result, a series of physiological and biochemical effects occur in parasites.Because the interaction proteins with calcium ion signaling protein may be the potential new drug receptors and targets, the research of the interaction proteins with calcium ion signaling protein will be of help to develop new drugs and biologics against parasites.However, we cannot further investigate the interaction proteins with calcium ion signaling protein until calcium ion activates calcium ion signaling protein.This paper reviews the important properties and action mechanisms of four calcium ion signaling proteins that exist in parasites and will provide useful information on future studies.

Ca2+; signal protein; calmodulin; calreticulin; calcium-dependent protein kinases; annexin

S852.7

A

1674-6422（2015）02-0078-09

2014-12-16

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2014JB03）

王自文，男，硕士研究生，预防兽医学专业

韩红玉，E-mail∶ hhysh@shvri.ac.cn；黄兵，E-mail∶ hb@shvri.ac.cn