提高鸡马立克氏病疫苗效价的技术措施

刘 超

（河北省霸州市畜牧兽医局，河北霸州 065700）

提高鸡马立克氏病疫苗效价的技术措施

刘 超

（河北省霸州市畜牧兽医局，河北霸州 065700）

鸡马立克氏病活疫苗生产的环节较多，细胞数量、细胞活力、接毒量、培养温度、血清质量以及营养液的质量等都是影响该疫苗产量的因素，而营养液质量更是重中之重。为了提高产品质量，我们对营养液主要成分进行了优化，通过添加细胞增殖剂，达到了提高疫苗效价的目的。

通过对3个不同厂家的血清从细胞贴壁和成品蚀斑计数两个方面进行选择，从而选择出了既有利于

细胞贴壁又能提高产品效价的血清；对水解乳蛋白选用高压蒸汽灭菌和除菌过滤两种方式进行对比，优化生产工艺，使水解乳蛋白营养成分得以保留，更有利于细胞的生产，增加蚀斑数量，提高疫苗效价。

1 材料

1.1 细胞和种毒

鸡胚成纤维细胞为10日龄SPF鸡胚，按常规方法制备；鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒FC-126株。

1.2 培养液

乳汉液、汉克氏液、胰酶消化液、SPGA液、M199基础培养基、血清、水解乳蛋白、增殖剂。

1.3 器材和设备

各种无菌的镊子、平皿、烧杯、漏斗、玻璃瓶、转瓶、纱布漏斗、三角瓶等；转瓶机、倒置显微镜、水浴锅、4℃冰柜、离心机。

2 试验方法

2.1 血清的选择

由于鸡马立克氏病活疫苗生产过程中一直使用牛血清，我们就随机选取了三家企业（国内1，国外1、国外2）生产的血清通过细胞贴壁、产毒量方面进行实验，并通过对企业生产方式以及销售价格方面进行比较，从中选出一种既能生产出高质量马立克氏病疫苗又可降低生产成本的血清。

2.1.1 不同厂家血清对细胞贴壁情况的影响

按《中华人民共和国兽用生物制品规程》制作鸡胚成纤维细胞悬液，分成三组分别加入等比例的国内1、国外1、国外2三家企业生产的牛血清，装入细胞培养转瓶，在温室内进行细胞贴壁培养。在培养到16h、20h、24h时分别观察细胞贴壁情况。共进行三次平行实验，对三家企业提供的牛血清进行比较。

2.1.2 不同厂家血清对产毒量的影响

在实验过程中分成三组，在制作鸡胚成纤维细胞和整个培养过程中分别加入等比例的国内1、国外1、国外2三家企业生产的牛血清，在贴壁后24h时直接接种鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒，继续培养72h收获细胞，分装、冻干后，对产品进行蚀斑计数（效力检验）测定，进行三次平行对比试验。

2.2 水解乳蛋白灭菌方式对比试验

按生产工艺要求制作水解乳蛋白水溶液，分成两组，分别采用高压蒸汽灭菌（116℃ 25min）和过滤除菌两种方法除菌后，分别测定无菌情况。并用除菌后的水解乳蛋白水溶液分别进行细胞培养和接毒，对生产出的产品进行蚀斑计数（效力检验）测定。

2.3 病毒增殖剂的使用对比试验

细胞培养添加剂提供了病毒复制时所需的营养成分，促进了病毒的复制，同时又具有营养细胞的功能。其主要效果：第一，促进细胞贴壁、延缓细胞老化、提高细胞的活力；第二，促进病毒复制，使完整病毒粒子数增加，缺陷病毒粒子数减少，提高疫苗的效价；第三，提高疫苗的病毒含量，增强免疫原性。

在原有鸡马立克氏病活疫苗生产用营养液中，按一定比例加入病毒增殖剂，来增强细胞的活力和加强细胞毒增殖。通过实验，分别对常规组与添加病毒增殖剂组马立克氏病活疫苗产品进行蚀斑计数（效力检验）测定。

3 结果

3.1 血清选择实验结果

3.1.1 不同厂家血清对细胞贴壁情况的影响

通过实验得出：国内1企业和国外1企业血清细胞贴壁情况趋于一致，但国内1企业血清在实验过程中观察死细胞较多；国外2企业血清无论在细胞的贴壁速度还是贴壁率方面，都要优于国内1和国外1企业血清。

3.1.2 不同血清对产毒量的影响

通过实验，国外2企业血清生产的疫苗效价明显高于其他两个厂家。

3.2 水解乳蛋白灭菌对比试验结果

试验对比数据得出：水解乳蛋白通过过滤除菌的方法好于高压蒸汽灭菌，可以提高成品效价10%以上。

3.3 病毒增殖剂的使用对比试验结果

通过实验得出，使用病毒增殖剂后，可以使产品的效价大幅提高，甚至成倍的增长。也表明在原有生产量不变的情况下，使疫苗的质量得到了很大的提高。

4 讨论

通过3个厂家血清对细胞贴壁情况及生产出的鸡马立克氏病活疫苗产品蚀斑计数结果的对比，可以看出，使用国外2厂家的血清，细胞贴壁情况效果最佳，而且生产出来的疫苗效价高。细胞贴壁的情况，直接影响蚀斑含量，影响着疫苗的效价。由于马立克病毒是细胞结合性病毒，在有相对多细胞的情况下，会引起足够多的细胞感染，所以细胞的贴壁情况对产品的效价影响很大。使用国外2厂家血清细胞贴壁效果好，所以效价最高。

根据对血清生产厂家的了解，国内厂家生产的血清普遍批量小、批次之间的差距大、质量参差不齐；在血清的制作过程中，对犊牛的选择不够严格；生产工艺不够精细。国外厂家血清批量大，能保证同一批次大量供货；在血清的制作中添加有利于细胞生长的因子；生产工艺优良，产品质量过硬。虽然国外2进口血清单价高于国内1，但采用国外2厂家血清生产的疫苗质量高于国内1厂家和国外1厂家，同时由于国外血清厂家能提供足够量的同批次血清，减少了批间差，能够保证生产顺利进行。

通过水解乳蛋白灭菌方式对比试验可以看出，由于水解乳蛋白水溶液在高压蒸汽灭菌时会造成营养成分流失，细胞的生长活力和病毒的复制受到影响；而采用除菌过滤方式水解乳蛋白营养成分得以保留，更有利于细胞的生长，增加蚀斑数量，提高疫苗效价。因此，我们在实际生产中采用过滤除菌的方法，不但促进了细胞的生长，同时也减少了试剂的浪费。

通过10批的病毒增殖剂使用对比试验，表明在改良营养液中细胞生长的形态更为典型、活力更好，同时在原有生产量的情况下产品的效价得到了大幅的提高。在过去生产中高蚀斑含量的疫苗只有通过增加抗原的用量，减少配苗分装的数量来实现。现在通过添加病毒增殖剂，在原有计划产量的基础上蚀斑含量提高了一倍，从而提高了产量及效价，大大降低了生产成本。

5 结论

成本。通过营养液的优化使我公司的鸡马立克氏病HVT活疫苗的生产逐步走向稳定、优质。

鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗优化培养研究有2年多的时间，应用到规模生产也有2年多的时间，经受住了市场和产业化生产的检验，结果证明该工艺已经得到完善，而且投放市场近5亿全份产品无一例免疫失败现象，树立了企业品牌，取得良好的社会效益和经济效益。

通过对不同厂家血清的选择、水解乳蛋白灭菌方式的对比、病毒增殖剂的使用来优化细胞营养液，不但增加了可利用的有效活细胞数量，也提高了病毒在生产过程的增殖，使产品效价由原来的每羽份蚀斑含量3 000～4 000 PFU提高到6 000～10 000 PFU；同时在没有优化营养液前每万羽份原材料投入是41.5元，优化后每万羽份的原材料投入是33元，既保证了产品质量又降低了生产