基于核酸检测诊断结核分枝杆菌感染的研究进展

路晓红，付玉荣，伊正君,3

基于核酸检测诊断结核分枝杆菌感染的研究进展

路晓红1，付玉荣2，伊正君1,3

结核病是由结核分枝杆菌感染而引起的传染性疾病。实验室诊断技术的不断进步，为结核病的诊断及治疗提供了多种选择方案。核酸检测是利用分子生物学的理论和技术，通过直接探查核酸的存在状态，从而对人体的状态与疾病做出诊断的方法。近年来，核酸诊断技术的发展极大地推动了实验室的快速诊断，本文就结核杆菌感染后细菌核酸及宿主微小核糖核酸检测方面的新方法、新技术进行综述。

结核分枝杆菌；分子生物学；核酸；微小核糖核酸

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，依据世界卫生组织(WHO)2013年全球结核报告[1]，2012年新发结核病患者约860万例，其中约130万例患者死亡(包括32万HIV阳性患者)。随着HIV的流行及耐多药结核(MDR-TB)的出现，结核病的控制难度不断增加，结核病的实验室诊断在结核病防治过程中起着至关重要的作用。目前结核病诊断的金标准仍是抗酸杆菌染色及结核杆菌培养，但阳性率低、时间长、延误治疗。而分子生物学新技术和新方法的不断涌现，对传统方法加以补充，具有灵敏度高、特异性好、检测快速快等优点，逐渐受到研究者和临床工作者的青睐和重视。本文就结核杆菌感染后细菌核酸的检测以及宿主微小核糖核酸检测进行综述，以期为结核病的诊断提供新的思路。

1 结核分枝杆菌核酸检测

结核分枝杆菌是一种独特的兼性胞内寄生菌，能够在巨噬细胞内生长繁殖。结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组已测序完成，全基因组由4 411 529 bp组成，GC碱基平均含量为65.6%，并且富含重复序列，尤其是插入序列。插入序列多数在结核杆菌中稳定出现，常用于结核杆菌鉴定。多态串联重复是结核杆菌染色体中一种主要类型的重复DNA，由10 bp的短串联重复序列被5 bp的间隔子分隔组成。分子生物学诊断主要通过检测患者痰液、血液、支气管冲洗液、病变组织等部位的结核杆菌核酸、蛋白等大分子物质，来确定是否存在结核杆菌感染。当前结核杆菌核酸检测的研究热点主要集中在核酸靶序列的选择以及各种聚合酶链反应技术的应用等方面。研究较多的靶序列主要有插入序列6110(IS6110)、MPB64基因、参与编码L-丝氨酸脱氢酶的Rv0069c(sdaA)、Rv3133c(devR)、热激蛋白65(HSP65)、编码早期分泌靶抗原(ESAT-6)基因、16S rRNA、以及耐药基因rpoB、katG、inhA、embB等。目前用于结核杆菌诊断的分子生物学方法主要有聚合酶链反应、基于聚合酶链反应的各种技术及基因芯片技术等检测技术。

1.1 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR) 自PCR技术发明以来广泛应用于医学和生物学领域，并极大的推动了实验室诊断技术的发展。PCR是在体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由变性、退火及延伸三步反应组成一个循环周期，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、速度快等特点。近几年在PCR基础上又发展了多种形式的PCR技术，提高结核杆菌检测的灵敏度及特异性。

1.1.1 多重PCR(multiplex PCR)检测技术 多重PCR是指在同一PCR反应体系中，加入两对以上引物，扩增得到不同的DNA片段，经凝胶电泳后产生多条条带。该方法特异性和敏感性均较高，且可以鉴别结核分枝杆菌复合体及非结核分枝杆菌。多重PCR可以根据需要选择不同菌株特异性引物进行检测，对于检测临床上两种或两种以上分枝杆菌混合性感染有重要意义。Kulkarni等[2]采用多重PCR扩增肺结核患者痰液标本中结核杆菌38 kDa基因和IS6110片段，并同时进行痰标本抗酸染色镜显微检查、细菌培养、及单基因PCR等检测，结果显示两种目的基因的多重PCR敏感度(81.7%)高于痰培养(69.2%)和抗酸染色法(53.3%)，在细菌培养阳性的标本中多重PCR的灵敏度较单基因PCR高。多重PCR提高了单基因PCR的敏感度，对于诊断涂阴样本十分有用。此外，这种方法还可以检测出IS6110缺失型菌株。Sharma等[3]研究发现，在确诊结核组中以IS6100和devR作为引物进行多重PCR检测的阳性率为97.5%，而以IS6100作为引物的单纯PCR阳性率为84.5%；在临床疑似结核组中，多重PCR和PCR的阳性率分别为45%和40%。Chia等[4]设计了一种改良的多重PCR，使用包括16S-23SrDNA的内部转录间隔区-1、热休克蛋白65和编码ESAT-6等基因的9对引物靶标，与传统培养和16SrRNA基因测序相比较，多重PCR的灵敏度及特异度均较高，并建议将改良的多重PCR在结核病高流行国家应用。Vadwai等[5]采用多重PCR通过检测katG315、rpoB531、gyrA94及rrs1401位点的突变来确定结核杆菌对异烟肼、利福平、氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物的敏感性，结果显示多重等位基因特异PCR在细菌培养阳性的患者检测准确率为97.2%，培养阴性的患者检测准确率为93.6%，涂阳患者检测准确率为100%和涂阴患者检测准确率为55.5%。其不足之处主要在于引物的设计及反应条件的优化存在，需要不断调整反应条件以至所有引物对扩增出目的条带。

1.1.2 实时荧光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)技术 实时荧光定量PCR扩增时加入一对引物和一个特异性的荧光探针，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时PCR技术能够有效解决PCR污染问题、且自动化程度高。Richardson 等[6]建立了多重实时定量PCR，即多重PCR和实时定量PCR技术相结合，他们采用此技术对314例临床标本分离株进行检测，结果显示其敏感度和特异度达到99%，且因为应用多对特异性引物，可快速对分枝杆菌进行分型。Kim等[7]首次报道利用多重实时荧光PCR可鉴别出20种分枝杆菌，利用多对不同引物及特异的探针逐步检测出各种分枝杆菌菌株，非常适用于非结核分枝杆菌的鉴定。Bainomugisa等[8]利用罗氏公司LightCycler 480 PCR仪进行实时荧光定量PCR来检测结核分枝杆菌及鸟分枝杆菌，结果显示结核杆菌及鸟分枝杆菌的检测灵敏度达到100%，特异度分别为99%和95%。Darban-Sarokhalil等[9]利用实时定量PCR技术扩增呼吸道标本中的结核杆菌cyp141基因，结果显示其总敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为90.2%、97.8%、97.1%和92.3%，并且其敏感度、特异度与Xpert MTB/RIF试剂盒检测相当，研究还显示其与结核杆菌分型存在相关性，提示cyp14可以作为结核定量检测的靶标。Riahi[10]等利用实时定量PCR检测利福平耐药性的敏感度及特异度可达到100%，提示其可用于利福平耐药的检测。

1.2 RNA恒温扩增实时检测(simultaneous amplification and testing, SAT) SAT是基于RNA恒温扩增技术发展起来的一项最新核酸检测技术，是国内自主专利技术[11]。该技术是核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。SAT基本原理是：在同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸RNA的1个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，每个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环，同时带有荧光标记的探针与RNA拷贝特异结合产生荧光，通过检测荧光信号来反应目标RNA的含量。此实验检测的底物是RNA，由于RNA容易降解，可减少其他核酸的污染。检测结果可区分死菌、活菌，更利于用药后疗效的监测，以及对是否治愈进行判断。Cui等[12]利用SAT技术以结核杆菌16S rRNA为靶标检测253例肺结核标本和134例非结核标本，SAT检测与Bactec MGIT 960培养的符合率为95.6%。SAT对肺结核检测的敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为67.6%、100%、100%和62.0%。程松等[13]以pre-16S rRNA为检测靶标设计RNA探针及带有T7启动子的逆转录扩增引物，42℃扩增实时检测在药物作用下pre-16S rRNA的变化，以Bactec MGIT 960为判定标准时，SAT检测利福平耐药株的敏感度为100%、检测敏感株的特异度为97.4%、阳性预测值及阴性预测值分别为96.2%和100%。

1.3 环介导等温扩增法 (loop mediated isothermal amplification, LAMP) 环介导等温扩增技术是针对靶基因的6个特异部位设计4个引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增。LAMP能够在等温条件下直接扩增临床标本中的结核杆菌DNA，不需要扩增仪，可肉眼直接观察结果，整个过程约需2 h。Bi等[14]进行的以hsp X基因为靶标的LAMP法检测可准确鉴别出不同的结核杆菌及非结核分枝杆菌，并且此实验可在27 min内完成，有望成为结核病高负担的发展中国家结核病的诊断方法。Li[15]等将管家基因Rv2461c作为LAMP扩增的靶标检测126份临床痰标本，结果显示其敏感度和特异度分别为84.8% 及95.7%，提示Rv2461c可作为结核杆菌核酸检测的新靶标。Kumar等[16]针对结核分枝杆菌早期分泌蛋白east-6基因设计3对引物进行LAMP扩增，其检测效率高于培养法，特异性与PCR相当，但其速度更快且费用低。但其对引物的要求特别高，扩增产物只能用于判断，并且特别容易形成气溶胶，造成假阳性。

1.4 单链构象多态性分析(single-strand conformation polymorphism，SSCP) SSCP技术是检测核酸单碱基突变可靠而简便的方法。其原理为DNA产物为两条互补单链，各单链的碱基序列的差异将形成不同的构象，即使是单个碱基发生突变亦可形成不同的空间构象，导致电泳的迁移率改变，在凝胶上亦会显示不同的带型以确定有无突变。将待测菌株的带型与结核标准株进行比较，即可判定待测菌株是否存在突变。一项meta分析[17]显示应用PCR-SSCP快速检测利福平耐药的敏感度为79%，特异度为96%，阳性似然比为16.10，阴性似然比为0.20，提示该法适用于利福平年耐药的快速诊断。很多文献报道关于PCR-SSCP用于结核杆菌基因突变和耐药性的快速检测[18-20]。采用PCR-SSCP 技术分析MDR-TB的耐药机理已成为研究热点。检测耐药基因有很强的特异性和较高的敏感性，与常规耐药性测定方法有很高的符合率，又可同时分析多个样本，很适用于临床检测。但该法只能用于确定有无基因突变而不能确定突变的部位和性质。

1.5 基因芯片(Gene Chips) 基因芯片的基本原理是将大量已知序列的寡聚核苷酸探针固定于支持物上，然后与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片可同时完成对样品多个序列的检测和分析，具有快速、高效的优点，可用于诊断分枝杆菌混合感染等复杂病例。芯片技术在检测结核杆菌、菌种鉴定、研究耐药基因以及基因组比较分析等方面具有巨大的发展潜力。Chang[21]等针对结核杆菌的13种特异的靶基因设计基因芯片用于临床标本的快速检测，其检测的阳性率为85%，并且可以检测出不同的亚种。Shi等[22]采用基因芯片法对临床分离菌株进行菌种鉴定及耐药性测定，检测出44株结核杆菌及10株非结核杆菌株，异烟肼耐药2株，利福平耐药1株，异烟肼和利福平均耐药1株。 Pang[23]等从多方面评价基因芯片技术在耐多药结核诊断中的价值，结果显示基因芯片检测利福平耐药的敏感度及特异度分别为87.56% 及97.95%，检测异烟肼耐药的敏感度及特异度分别为80.34% 和95.82%，其检测效果优于传统药敏试验，并且高效、快速及安全。Zimenkov等[24]针对基因gyrA、gyrB、rrs及 eis 启动子区域序列设计寡核苷酸微阵列来检测泛耐药结核(Extensive Drug Resistant TB, XDR-TB)，氟喹诺酮耐药检测敏感度为98%、特异度为100%，卡那霉素耐药检测敏感度为97%、特异度为94%，链霉素耐药检测敏感度为100%特异度为94%。但基因芯片制作复杂，需要昂贵的特殊仪器，因而限制了它在临床应用的普及。

2 宿主微小核糖核酸(micro RNA, mi RNA)检测

miRNA是一类存在于真核细胞中的非编码小RNA，可以调控基因转录后表达。最近研究发现，结核杆菌感染宿主后引起宿主miRNA产生一系列变化，并且miRNA在结核感染的不同阶段表达类型及含量亦会随之改变，随着对miRNA研究的不断深入，发现其在机体抗结核免疫反应中具有重要作用。miRNA种类及含量的变化可能提示结核感染的不同状态，例如能够鉴别潜伏性结核感染与活动性肺结核等，因此miRNA有望成为结核感染新的检测靶点。

潜伏性结核感染 (latent tuberculosis infection, LTBI) 通常是指宿主感染结核杆菌，皮肤结核菌素试验呈阳性，但未出现活动性结核的临床症状及影像学改变。Wang等[25]利用miRNA微阵列检测潜伏性结核感染者、活动性肺结核患者和正常人群miRNA表达情况，发现LTBI患者组血清中的 miR-130b*、miR-342-5p、miR-155、miR-181b、miR-548b-3p表达显著低于活动性结核组及正常对照组。有研究发现活动性肺结核患者的血清及痰液等标本的中存在miRNA的差异表达。Fu等[26]首次采用miRNA芯片技术检测活动性肺结核患者与正常人群的循环miRNA。该研究显示活动性结核患者血清中有92个miRNA变化显著，59个miRNA表达下调，33个miRNA表达上调。当用qRT-PCR进行验证时发现，miR-3125 在血清中低表达；miR-29a在血清及痰液标本中表达均升高；miR-93*在患者血清中高表达，在痰液中表达与正常组无显著性差异。Yi等[27]采用芯片技术筛选出活动性肺结核患者的痰液上清中差异表达的miRNA，与健康对照组相比，结核病患者痰液中发现95个差异表达的miRNA，miR-3179和miR-147过表达，miR-19b-2*表达降低。因此，有望把循环miRNA作为活动性结核诊断的生物标志物及生物治疗的靶点。Wu等[28]利用结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)对活动性肺结核患者的外周血单个核细胞进行诱导，miRNA微阵列进行检测，并采用RT-qPCR进行定量分析，结果显示miR-155和miR-155*的含量显著高于正常对照组。提示miR-155和miR-155*可能成为结核杆菌感染的新的诊断标记。

3 结 语

结核病仍旧是一种严重危害人类健康的传染性疾病，结核病的防治工作任重而道远。分子生物学诊断技术具有灵敏度高、特异性强、速度快等优点，在结核分枝杆菌诊断领域具有巨大的发展潜力。目前很多检测技术及方法正处于由实验室转向临床应用的过渡阶段，同时也面临诸多问题，如需要精密仪器，操作者需要进行专业培训，存在一定的假阳性率等问题。结核杆菌的核酸检测与宿主miRNA检测相结合或许能够准确地确定病原菌，又能够提示患者结核感染的不同阶段，为临床结核病的早诊断，早治疗及优化治疗方案提供有价值的参考。同时，特异的结核杆菌核酸及宿主miRNA有待进一步挖掘，以期为临床的诊断及治疗提供有价值的指标。

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Research progress in molecular biological diagnosis of tuberculosis infection

LU Xiao-hong1,FU Yu-rong2,YI Zheng-jun1,3

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China;2.DepartmentofMedicalMicrobiology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China;3.TheAffiliatedHospitalofWeifangMedicalUniversity,Weifang261031,China)

Tuberculosis is an infectious disease caused byMycobacteriumtuberculosis. The rapid development of laboratory diagnostic technology provides a variety of options for diagnosis and treatment of tuberculosis. Nucleic acid detection is to use the theory and technology of molecular biology, through direct detection of status or defect of particular segments, then make diagnosis of the state of human body and disease. In recent years, the development of nucleic acid diagnostic technique has greatly promoted the rapid diagnostic of laboratories. This article reviews the new methods of bacterial nucleic acid and host microRNAs detection technologies.

Mycobacteriumtuberculosis; molecular biology; nucleic acid; micro RNA

Yi Zheng-jun, Email:fuyizhengjun@163.com

国家自然科学基金资助(No.81470001;No. 30972639)

伊正君，Email:fuyizhengjun@163.com

1.潍坊医学院医学检验学系，潍坊 261053； 2.潍坊医学院病原生物学教研室，潍坊 261053； 3.潍坊医学院附属医院检验科 ，潍坊 261053

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.015

R378.91

A

1002-2694(2015)10-0967-05

2015-05-04；

2015-07-26

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81470001 and 30972639)