产前诊断病例母体细胞鉴定污染方法的建立及临床应用

杨 昕，李发涛，甄 理，潘 敏，李东至，韩 瑾

(广州市妇女儿童医疗中心产前诊断门诊，广州 广东 510623)

【出生缺陷预防】

产前诊断病例母体细胞鉴定污染方法的建立及临床应用

杨 昕，李发涛，甄 理，潘 敏，李东至，韩 瑾

(广州市妇女儿童医疗中心产前诊断门诊，广州 广东 510623)

目的 建立单基因病介入性产前诊断的母体细胞污染鉴定技术，对绒毛穿刺、羊水穿刺及胎血穿刺的标本进行母体细胞污染的鉴定，以降低误诊率。方法 选择8个短串联重复序列(STR)位点，建立短串联重复序列-聚合酶链式反应(STR-PCR)方法，并建立母体细胞污染的浓度梯度模型，对2 120例产前诊断标本进行检测，比较羊水穿刺、绒毛穿刺及脐血穿刺母体细胞污染的发生率。结果 共施行约2 120例产前诊断标本，采用STR-PCR方法检测标本1 452例，其中羊水穿刺标本1 022例，脐血标本229例，绒毛标本201例。3种方法检测到母体细胞污染病例共19例，其中羊水16例(1.6%)，绒毛2例(1.0%)，脐血1例(0.4%)。在19例检测到母血细胞污染的病例中，污染比例在25%以上的病例有2例，污染比例10%以上的有18例。结论 在产前诊断标本中，羊水穿刺母体细胞污染发生率较高。在单基因遗传病产前诊断中，应常规进行母体细胞污染的检测。

产前诊断；标本；母体细胞污染；短串联重复序列-聚合酶链式反应

介入性产前诊断目前仍是胎儿染色体检查和单基因遗传病诊断的主要方法。随着分子生物学技术的发展，越来越多的单基因遗传病可以通过在孕早期绒毛穿刺或孕中期羊水穿刺进行产前诊断。尽管诊断不同单基因病的具体实验室技术差异很大，但大部分仍然是通过基因扩增所采集的胎儿组织，然后对扩增产物进行分析。由于基因扩增的高度敏感性，即使微量的母体组织污染都可能干扰基因诊断结果，发生严重的临床后果。因此，鉴定所取胎儿组织是否存在母体污染是产前诊断分子遗传实验室必需具备的鉴别技术。

2008年，英国临床分子遗传协会(CMGS)制订了产前诊断标本分子检测母体细胞污染(maternal cells contamination，MCC)的检测规范。在规范中明确建议所有单基因病的产前诊断结果必须包括母体细胞污染的鉴别实验。且鉴别母体细胞污染的实验技术应最少能检测出10%比例的母体细胞污染的产前诊断样本[1]。

2010年1月至2014年1月，广州市妇女儿童医疗中心产前诊断门诊产前诊断中心采用短串联重复序列(short tandem repeat,STR)PCR方法建立了母体细胞污染的鉴定体系。本研究的主要目的是建立母体细胞污染的检测方法并检测产前诊断标本中母体细胞污染的发生率及绒毛、羊水、脐血穿刺病例母体细胞污染发生率的比较分析。

1 对象与方法

1.1 短串联重复序列位点选择

为了选择高度多态性的STR位点，本中心对所选21个STR位点进行了400例样本人群多态性分析，选择杂合率较高的8个STR位点作为母体细胞污染鉴定的主要扩增位点。

1.2 实验方法

1.2.1 实验仪器

PCR仪 ABI3100遗传分析。

1.2.2 实验试剂

DNA extraction Kit[Qiagene]；PCR reagent(Shanghai Promega)；10×PCR Buffer；dNTPs；Mgcl2；Taq 酶；HiDi甲酰胺；Size Standard(Rox 500HD) 。

1.2.3 实验步骤

DNA提取：详见 Qiagen Kit试剂说明，提取DNA浓度及OD值附在结果报告中。 DNA浓度要求大于20ng/μL，OD260/280要求介于1.5～2.0之间。

PCR：为了保证PCR体系的敏感性，将8个STR位点的扩增引物分为两组，每组包含4个STR位点进行扩增。扩增体系如下：Master Mixture total volum：23μl；DNA ：50～100ng/μL (1～2μL)；PCR Protocol： 10× Buffer 2.5μL； dNTPs(2.5mM) 2μL Mgcl2(25mM) 2μL；Primers(2.5mM) 2μL；Taq酶(5IU/μL) 0.2μL；H2O 11μL Total volume 25μL。PCR程序：95℃5min；95℃ 10s；58℃ 30s；72℃ 45s；40cycles 4℃ forever。

变性：将0.5μL Genescan 500HD[rox] size standard 加入 8μL formamide中，充分混合，瞬时离心，将PCR产物2uL加入到混合液中，混合离心。95℃变性5min，迅速放入冰水混合物中冷却3min，置入ABI 3100遗传分析仪中电泳。

1.3 母体细胞污染梯度模型的建立

随机选取两组正常母亲/胎儿的DNA标本，分别测量DNA浓度及OD260/OD280值，将两样本(母亲/胎儿)DNA按照50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%比例进行稀释，建立母体细胞污染的人工模型，见图1，并采用以上建立的STR-PCR体系对此模型进行检测。

1.4 样本来源

2013年至2015年1月，本产前诊断中心开始对所有因家族遗传性单基因病(主要包括地中海贫血、血友病等)而前来我院接受产前诊断(包括绒毛穿刺、羊水穿刺及脐血穿刺)的标本进行STR-PCR检测，所有孕妇于穿刺前均知情同意并签署知情同意书。当STR-PCR结果提示阴性时方发放产前诊断报告，而当结果提示存在母体细胞污染时，应告知孕妇并建议重新进行二次产前诊断。

1.5 统计学方法

采用Genescan 3.7 软件对数据进行分析。

2 结果

2.1 短串联重复序列选择

2012年本产前诊断中心建立了以快速检测常见染色体病为主要目的的分子生物学方法。此方法采用21个STR位点对21、18、13及性染色体进行检测，检测准确率达到97.5%以上[2]。本研究在以上成果的基础上挑选了8个杂合率较高的STR位点作为母体细胞污染鉴定的基本位点。8个等位基因片段大小、杂合度、多态信息量、个体识别力和非父排除率，见表1。

表1 广东汉族人群8个STR等位基因片段大小、杂合度、多态信息量、个体识别力和非父排除率分析

2.2 母体细胞污染模型的建立

本检测体系对2组模型分别进行检测，发现在6个不同稀释比例的标本中，2组模型中6.25%以上稀释比例的标本均能够检测，见图1。而3.125%的稀释比例中，仅有1组标本能够清楚显示。因此在标本检测结果中，如发现MCC阳性，则代表MCC的比例不低于10%。

注：对样本DNA质量要求：DNA浓度：20～100ng/mL，OD260/OD280：1.6。

图1 母体细胞污染不同浓度梯度参照标准

Fig.1 Reference standard for different concentration gradient of MCC

2.3 产前诊断样本的检测

2012年10月至2014年6月，本中心共施行约2 120例产前诊断标本，采用STR-PCR方法检测标本1 452例，其中羊水穿刺标本1 022例，脐血标本229例，绒毛标本201例。3种方法检测到MCC病例共19例，其中羊水16例(1.6%)，绒毛2例(1.0%)，脐血1例(0.4%)。在19例检测到母血细胞污染的病例中，污染比例在25%以上的病例2例，10%以上的18例。

3 讨论

众所周知，目前产前诊断的主要途径为超声引导下经母体腹部行绒毛(或羊水、脐血)穿刺术，因此在取材的标本中，不可避免的会存在母体组织成份的污染。随着分子生物学技术的发展，越来越多的单基因遗传病可以通过在早、中孕期进行诊断，由于基因扩增的高度敏感性，即使微量的母体组织污染都可能干扰基因诊断结果，发生严重的临床后果[3]，因此，鉴定所取胎儿组织是否存在母体污染是分子遗传实验室必需具备的技术。2005年，Stojilkovic-Mikic等[4]采用QF-PCR技术对254例羊水标本进行检测，发现39.8%的标本存在母体细胞的污染，母体细胞污染的比例由5%至100%不等，由此可见，在进行有创性产前诊断手术中，母体细胞污染的比例是相当高的。在美国一项多中心的调查报告中，35个产前诊断中心有34个对所有的产前诊断样本进行MCC的检测[5]。2008年，英国临床分子遗传协会制定了关于产前诊断中MCC检测方法建立的规范，要求所有单基因病的产前诊断都应该进行MCC鉴定，且分子产前诊断报告应在MCC检测报告完成后交给病人[1]。

在我国，由于产前诊断技术开展的时间较晚，关于产前诊断标本母体细胞污染的检测仍未受到足够的重视。2010年，本中心开始将QF-PCR技术应用于临床[4]，为孕妇提供21、18及13三体综合征的快速分子诊断。针对母体细胞污染检测本身要求较高杂合率的特点，重新选择并优化了STR位点，采用8位点单管PCR扩增的方法，既保证了检测结果的特异性，同时还保证了检测结果的敏感性。2012年10月至2014年6月，采用该方法共检测产前诊断标本2 120例，共发现19例产前诊断标本存在不同程度的母体细胞污染，其中羊水标本中出现MCC的几率最高，这与侯巧芳等[6]的研究结果相一致，但是该研究未经培养的羊水和绒毛MCC发生率分别达到3.1%和5%。而在本研究中，所有的羊水标本均为培养后标本，MCC检出率仅为1.6%。在2例绒毛MCC的病例中，其中1例实际上完全为母体组织，后通过二次穿刺(羊水穿刺)得到确诊。通过该病例显示出，在绒毛穿刺中，经验丰富的手术医生及抓取典型的绒毛组织是保证诊断结果的重要前提。同时在进行母体细胞污染鉴定时，应同时对母体DNA进行检测并作为对照。

虽然本研究初步建立了产前诊断标本中母体细胞污染的鉴定体系，但由于仅仅为相对定性的诊断，因此当我们发现样本存在母体细胞污染时，只能根据已有的模型做出粗略的定性，不能对母体细胞污染的程度进行精细的定量。另外一点需要注意的是，本研究所建立的MCC 鉴定体系是以检测敏感性为10%以上的污染比例为基础的，当母体细胞污染的比例小于10%时，本方法可能无法检测，因此我们在对产前诊断标本进行单基因病的检测时，也需要清楚母体细胞污染在什么情况下可以显著影响基因诊断的结果，并对孕妇及家属进行充分的告知。

[1]Allen S, Mountford R, Butler A,etal.Practice guidelines for the Testing for maternal cell contamination (MCC) in prenatal samples for molecular studies[Z].Guidelines ratified by the UK Clinical Molecular Genetics Society,2008.

[2]梁丽,廖灿,潘敏,等.荧光定量聚合酶链反应技术快速产前诊断常见染色体非整倍体的临床应用[J].中华围产医学杂志,2012,15(2):106-112.

[3]Winsor E J, Akoury H, Chitayat D,etal. The role of molecular microsatellite identity testing to detect sampling errors in prenatal diagnosi[J]. Prenat Diagn, 2010,30(8): 746-752.

[4]Stojilkovic-Mikic T, Mann K, Docherty Z,etal. Maternal cell contamination of prenatal samples assessed by QF-PCR genotyping[J]. Prenat Diagn, 2005, 25(1): 79-83.

[5]Schrijver I, Cherny S C, Zehnder J L.Testing for maternal cell contamination in prenatal samples: a comprehensive survey of current diagnostic practices in 35 molecular diagnostic laboratories[J]. J Mol Diagn,2007,9(3):394-400.

[6]侯巧芳,廖世秀,李涛,等. 产前诊断标本的母体细胞污染及其影响[J]. 中华妇产科杂志2013,48(2):86-91.

[专业责任编辑：于学文]

Establishing methods to detect maternal cells contamination in cases for prenatal diagnosis and clinical application

YAND Xin, LI Fa-tao, ZHEN Li, PAN Min, LI Dong-zhi, HAN Jin

(PrenatalDiagnosisCenter,GuangzhouWomenandChildrenHospital,GuangzhouGuangdong510623,China)

Objective To test maternal cells contamination (MCC) in samples of choriomic villus puncture, amniotic fluid puncture and cord blood puncture by establishing the test technique of MCC in interventional prenatal diagnosis of monogenic disease so as to reduce misdiagnosis rate. Methods Eight STR sites were selected to establish STR-PCR method and MCC concentration gradients. Totally 2 120 prenatal samples were detected to compare the incidence of MCC among choriomic villus puncture, amniotic fluid puncture and cord blood puncture samples. Results Totally 2 120 prenatal diagnosis samples were performed, and 1 452 samples were tested by STR-PCR method, including 1 022 amniotic fluid puncture samples, 229 cord blood samples and 201 choriomic villus samples. There were 19 cases with MCC detected by three methods, including 16 (1.6%) cases with amniotic fluid puncture, 2 (1.0%) cases with choriomic villus puncture and 1 (0.4%) case with cord blood puncture. Of 19 cases there were 2 cases with contamination over 25% and 18 cases with contamination over 10%. Conclusion In prenatal diagnosis samples, the incidence of MCC is relatively high in amniotic fluid puncture samples. MCC detection should be performed as a routine test in prenatal diagnosis of monogenic disease.

prenatal diagnosis; sample; maternal cells contamination (MCC); short tandem repeat (STR)-PCR

2015-06-02

广州市医药卫生科技项目(项目编号：2013A011040013)

杨 昕(1977-)，男，主治医师，硕士，主要从事胎儿医学的研究。

韩 瑾，副主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.055

R714.55

A

1673-5293(2015)04-0815-03