免疫芯片技术在兽药残留检测中的应用

曲信芹，凌红丽，蒋贻海，赵 明

（青岛蔚蓝生物制品有限公司，山东青岛 266114）

免疫芯片技术在兽药残留检测中的应用

曲信芹，凌红丽，蒋贻海，赵 明

（青岛蔚蓝生物制品有限公司，山东青岛 266114）

免疫芯片是一种高通量、高灵敏度、高特异性的多元检测分析技术，近几年来呈现突飞猛进的发展，引起各个领域广泛的关注及重视。本文就免疫芯片技术的原理、特点，以及在抗生素残留、 激素类药物残留、磺胺类药物残留等兽药残留检测中的应用进行阐述，以期将免疫芯片技术广泛应用于生物科学研究及实践领域。

免疫芯片；兽药残留；检测

兽药残留是指在动物用药后，药物在动物体内的化合物、代谢物及杂质成分的残留。目前，国内外已制定了兽药管理规范，但兽药残留超标情况仍十分严重。日常生活中，人们由于科学知识的匮乏和经济利益的诱惑，滥用兽药及饲料添加剂的情况普遍存在，造成动物源性食品中药物残留的情况日趋严重，给人类身体健康带来了严重危害。

随着经济水平的提高，人们对食品安全的重视和关注程度也不断增强，畜禽产品药物残留严重超标成为食品安全潜在的威胁。为了保障食品安全及人类健康，必须对兽药残留进行监管[1]。实现监管和控制的目标，高效灵敏的检测方法必不可少。兽药残留检测方法主要有色谱分析法（气相、液相）、微生物检测法和免疫分析法（酶联免疫吸附分析ELISA、胶体金、免疫芯片检测）等。这几种方法存在检测成本高、操作复杂、灵敏度低、不适应大量样品检测分析的缺点，使其应用受到限制。近几年来，免疫芯片技术的飞速发展，其特异性强、高通量、快速、敏感性高的优点，可有效降低检测成本、提高效率，已被广泛应用于兽药残留检测方面[2]。郭志红等首次使用蛋白免疫芯片技术对猪、鸡样品中克伦特罗、链霉素进行检测，验证其与ELISA试剂盒的检测结果有很好的一致性，且能同时检测多种药物。“兽药残留蛋白质免疫芯片检测系统”的研制成功，是第一个能够检测肉类样品中兽药残留的生物芯片系统[3]，成为目前动物源性食品药物残留检测的研究热点。

1 免疫芯片

生物芯片技术是上世纪90年代发展起来的高新技术，并在国内外迅猛发展。随着多种不同功能的生物芯片问世，在分子生物学、疾病的预防、诊断、新药开发、环境污染监测、农兽药残留及生物武器等方面广泛应用。生物芯片根据形态可分为平面固态生物芯片和悬浮液态生物芯片；根据成分可分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等。纵观生物芯片的发展，以蛋白微阵列检测用芯片发展最为迅速[4]，蛋白质芯片是将生命科学与微电子学相互渗透的新技术，与基因芯片一样具有高灵敏度、快速的优点，在后基因组计划和生物医学领域及药物残留检测等方面有着重要的作用。

免疫芯片又称抗体芯片，是一种最重要的蛋白质芯片[5-7]，是指将抗原或抗体包被在固相载体上，通过特异性免疫反应捕获样品中的目的蛋白，然后经过检测系统对标记物质信号强弱进行检测，从而判定样品中靶分子的含量。它是在基因芯片之后提出的一种新型生物芯片，可一次性同时完成几万或更多数量的生物样品的检测分析，成为生命科学研究领域中强有力的工具。

1.1 免疫芯片技术原理

上世纪80年代，Roger Ekin最早提出蛋白免疫芯片检测技术的原理，免疫芯片上的探针蛋白可根据研究目的选用抗原、抗体、受体等具有生物活性的蛋白质[8]，通过物理或化学方法将探针高密度固定于芯片上，利用抗原、抗体之间的亲和作用与电子芯片高密度集成原理相结合而产生的一种全新概念的生物芯片检测技术，对样品中存在的特定分子进行检测。

1.2 免疫芯片技术特点

免疫芯片的制作过程包括芯片载体表面的化学处理、抗原或抗体的预处理、芯片的点印、固定和封阻等。由于该技术具有探针特异性高、亲和力强、敏感性高且受杂质影响小，对生物样品要求低（尿液、血液、组织和细胞），可简化样品的前处理过程（离心）的优势，使其成为临床生物样品和蛋白质表达样品检测中的重要力量。因此，免疫芯片技术具有强大的高通量平台优势[9]，已被科研人员及医务工作者应用到生命研究的各个领域。

2 免疫芯片在兽药残留检测中的应用

2.1 抗生素残留检测

抗生素是指微生物在生长繁殖过程中产生的一类具有杀灭或抑制微生物生长的物质，也可通过人工合成。自青霉素问世以来，各类抗生素在畜禽养殖业广泛应用，不可避免地造成抗生素残留，对人们的健康造成潜在的威胁[10]。食品中残留过量的抗生素使某些致病菌产生耐药性，严重影响抗生素的疗效，人体长期食入抗生素残留超标的食品会产生急慢性中毒作用，如氯霉素可引起人体骨髓造血功能障碍、氨基糖苷类对肾脏造成毒性，甚至引起致癌反应。因此，动物源性食品中抗生素残留量要严格控制。

Kloth等建立了一种可再生、定量快速检测原料奶中的13种抗生素的免疫芯片方法，检测结果均符合EU组织所制定的官方标准，实现了一份样品可检测多指标的目的。Su等[11]根据间接免疫竞争法的原理实现同时定量检测出牛奶中5种抗生素包括泰乐菌素、四环素、庆大霉素、链霉素、氯霉素的免疫芯片技术，通过系列优化和筛选试验条件，使检测灵敏度、稳定性及信号强度都有了显著提高。同时与ELISA方法和液相色谱法比较，结果表明芯片技术的灵敏度较其他两种方法高，且操作简单、快速，检测范围分别为：泰乐菌素0.026～400ng/mL、庆大霉素 0.4～25.6ng/mL、四环素 0.05～781.25ng/mL、链霉素 0.08～1 250ng/mL、氯霉素0.5～7812.5ng/mL，大大降低牛奶中干扰因子对检测灵敏度的影响，为检测试剂盒的开发奠定了基础。免疫芯片技术降低检测的操作步骤，其快速、高通量等特点适合大规模检验工作。李周敏、许丹科等[12]采用间接免疫法，在固定有庆大霉素抗原的芯片内加入单克隆抗体及纳米银标记二抗及银增强剂显色剂，实现了牛奶中庆大霉素可视化蛋白芯片检测，该法使庆大霉素的检测范围为0.1～200 ng/mL。Poller等通过研究较优的芯片表面化学处理方法，能够快速灵敏检测牛奶中恩诺沙星的残留量。

2.2 激素类药物残留检测

激素类药物包括皮质激素、孕激素、雌激素及β-受体激动剂等能调节组织细胞的代谢活动，对动物机体生长、发育、繁殖活动产生影响的一类药物。激素类药物在动物源性食品中的残留，危及食品卫生安全和人类健康。世界各国对动物源性食品中激素类兽药的控制越来越严格，对其检测方法也有了更高的要求。克伦特罗及莱克多巴胺均可促进猪体生长，减少脂肪含量，提高瘦肉率，因药效显著、价格便宜而大剂量使用在饲料中，一旦食入人体，引起急性中毒，给人类带来严重危害。

刘天龙等[13]建立了一种方便、稳定的检测牛奶中头孢氨苄和莱克多巴胺的免疫芯片技术，通过对头孢氨苄和莱克多巴胺合成抗原包被条件和单克隆抗体的稀释条件进行优化，使其对头孢氨苄和莱克多巴胺的检测限分别为20.59 ng/mL和23.51 ng/mL，处理方法比液相色谱、质谱法简单、快速。孙来玉、尹莉等[14]建立瘦肉精克伦特罗残留检测免疫芯片方法，通过微阵列技术将克伦特罗与硝酸纤维素膜结合，封闭硝酸纤维膜后加待测样品和标记品，借助标记品的发光强度来测定盐酸克伦特罗的浓度，使盐酸克伦特罗残留检测限为0.10 ng/mL，定量限为0.3 ng/mL，检测范围为0.5～16.0 ng/mL，该方法具有很高的特异性，未发现与沙丁胺醇、特布他林、莱克多巴胺、塞曼特罗、酚间羟异丙肾上腺素、异丙肾上腺素等构效类似物发生交叉反应。

2.3 磺胺类药物残留检测

磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物，主要通过口服、创伤及饲料添加剂而残留在动物源性食品中，能抑制大多数革兰氏阳性菌及少数阴性菌的生长繁殖[15]。在近几十年来，动物源性食品中磺胺类药物残留量超标现象十分严重，多在猪、牛、禽等动物源性食品中发生，农业部235号令规定动物源性食品中磺胺类药物最高限量为100 μg/kg。陈爱亮等[16]设计了一种简便快速的样品制备方法，能够从组织样品同时提取多种残留兽药。该系统可用于畜禽食品中磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、磺胺间甲氧嘧啶、链霉素、双氢链霉素、恩诺沙星以及氯霉素的定量检测，证明免疫芯片在药物残留检测中灵敏度、准确度及交叉反应满足了兽药残留检测的要求。郭志红等[17]应用蛋白免疫芯片技术检测了猪、鸡组织中的盐酸克伦特罗、链霉素、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星的残留量，并与ELISA法、色谱法和微生物检测法做比较，结果表明蛋白芯片检测前处理方法简单、快速，结果确实可靠。

免疫芯片技术实现了兽药的多残留检测，显示出并行性和高通量性，集成化和自动化，适合大量样品检测，因此成为药物残留检测发展的一种趋势。它不仅局限于一类药物的检测，也可同时检测多类药物，显示出高通量多元检测分析的特点。Liu等[18]基于间接竞争法的免疫学检测原理，改进了免疫芯片抗体固定的方法，实现了可一次检测4 种兽药（氯霉素、克伦特罗、雌二醇和泰乐菌素）和 3 种农药（阿特拉津、吡虫啉和甲萘威）的残留量，比ELISA方法具有更高的灵敏度和可靠性，检测方便、快捷、节省试验时间及成本。

3 前景展望

免疫芯片技术的飞速发展为人们提供了良好的检测手段，而其也存在一些缺点，如芯片需经操作复杂、成本较高的醛基化修饰、琼脂糖凝胶等工艺，因此限制了免疫芯片的应用范围。发展安全、健康、和谐的可持续发展畜禽养殖业是当代人们前进的方向，随着人们对食品安全的关注及要求日益提升，合格的动物源性食品是人类健康的重要保证。建立特异性好、灵敏度高的检测方法才能满足当前快速准确检测的要求。免疫芯片技术因其自身的特点在食品安全检测领域具有较大的发展潜力，成为高通量检测技术的主体[19]，为兽药残留监测提供了可靠的依据及检测手段。

免疫芯片不仅限于兽药残留方面的检测，在蛋白质组学研究、基因表达筛选、自身抗体疾病诊断及生物分子间相互作用等方面也有应用。国内外诸多生物公司（美国Affmetrix、PerkinElmer公司，中国北京博奥生物芯片有限公司、上海博德基因开发有限公司等）已将蛋白免疫芯片应用于食品安全检测和生物医学领域的深入研究，并开发出检测试剂盒等商业化产品。免疫芯片技术将会继续被广泛应用于生物科学研究及实践领域，随着新材料、新技术的发展和投入，免疫芯片技术也会越来越完善，在生物和医学研究领域中发挥其最大的作用。

Application of Immunochips in Veterinary Drug Residue Detection

Qu Xinqin，Ling Hongli，Jiang Yihai，Zhao Ming
（Qingdao Vland Biological Products Co. Ltd，Qingdao，Shandong 266114）

Immunochip is a multiple analytical technique of high throughput，high sensitivity and high specificity with rapid development in recent years and has aroused wide attention in variousfields. The principle of immunochip technology，characteristics and application in the veterinary drug residues detection were described in this paper in an attempt to promote its application in biological research and practicalfield.

immunochip；veterinary drug residue；detection

S859.79 文献识别码：A

1005-944X（2015）10-0021-04

青岛市国际合作项目（项目编号：13-1-4-272-hz）

课题名称：动物源性疫病高通量快速检测免疫芯片的研制与开发

凌红丽

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白雅娟）