附红细胞体病动物模型研究进展

刘寰宇，陈 瑶

（内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010110）

·综述·

附红细胞体病动物模型研究进展

刘寰宇，陈 瑶

（内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010110）

附红细胞体病动物感染模型对于附红细胞体病发病机制的研究、药物的筛选具有至关重要的作用．总结近年来国内外附红细胞体病动物感染模型的研究，在实验动物的选择、动物模型的制作、模型的评价等方面对附红细胞体病动物模型的研究情况进行综述，为今后附红细胞体病的研究提供依据．

附红细胞体病；动物模型；研究进展

0 引言

附红细胞体病是由附红细胞体附着在红细胞表面、血浆及骨髓内引起人和动物出现不明原因的发热、黄疸、脱发等症状的一种人蓄共患传染病［1］．在传播方式、生物学分类、发病机制、药物筛选、预防感染等方面存在许多争议．附红细胞体病是条件性致病，具有感染率高，发病率低的特点［1］，不受临床医生和患者的重视，临床资料远远少于实验室研究．而关于实验室研究方面的报道也相对少，且具有阶段性特点，与动物模型相关的研究尚未成熟，因此建立附红细胞体病动物模型对推动附红细胞体病的发病机制、感染预防等方面的研究至关重要．

1 实验动物的选择

1．1 猪 猪作为附红细胞体病的常见宿主，经常被选作动物模型．但是把猪作为实验动物存在实验成本高、不易操作、SPF猪仔难以获得等缺陷．马增军等［2］采用附红细胞体接种猪后，猪感染附红体并发病．

1．2 绵羊 马增军等［2］用猪附红细胞体接种羊，成功复制出羊附红细胞体病动物模型．模型动物在潜伏期有精神萎靡、食欲减退等临床表现，在高峰期有结膜苍白、黄染等临床表现．

1．3 兔子 家兔对致病菌敏感，是寄生虫病、人兽共患病常用的实验动物，且家兔对体温变化十分敏感，利用家兔更容易观察附红细胞体病所引起的临床症状［3］．1995年裴标等［4］用一例附红细胞体阳性的急性溶血性贫血患儿血液经耳缘静脉接种家兔，成功复制出感染模型．2002年杨自军等用猪附红细胞体通过耳源注射感染家兔，感染3 d后，家兔表现出精神欠佳、食欲减少、全身无力、不愿活动等亚健康状态．戴荣四等［5］用奶牛附红细胞体感染兔后，兔出现发热、贫血、黄疸等典型临床症状．

1．4 豚鼠 豚鼠对多种病原体敏感，常用于病原的分离及诊断．其中FMUN白话豚鼠有独特的免疫学特性，红细胞免疫功能比普通花色豚鼠低，对病原体敏感性高于普通花色豚鼠，更适于建立感染性疾病动物模型．顾为望［6］等利用人附红细胞体分别感染普通花色豚鼠和FMUN豚鼠，发现FMUN豚鼠对人附红细胞体敏感性高于普通花色豚鼠．

1．5 小鼠 小鼠具有易于管理、控制等优点，被广泛地应用于多种病原体感染和疾病模型的建立［7］．李芬等［8］用反刍兽源附红细胞体感染小鼠后，经腹腔注射阳性奶牛血液的方式成功建立动物模型．冯会全等［9］用猪附红体腹腔注射小鼠的方法成功建立了小鼠附红细胞体病模型．唐莲莲等［3］则认为小鼠恒温机能差，对发热刺激的反映低，不是首选动物．而且小鼠的血量少，进一步提高了实验难度．

1．6 SD大鼠 冯会全等［10］用腹腔注射阳性血液的方式经PCR检测成功建立了SD大鼠模型．

1．7 Wister大鼠 孙英峰等［11］用阳性血液样品分别经腹腔、皮下、肌肉感染 Wister大鼠，并用套式PCR方法进行检测，成功建立了大鼠模型．

1．8 免疫抑制剂的使用 附红细胞体病是条件性致病，当机体免疫力正常时，附红细胞体病通常表现为隐性感染而不发病，当机体免疫力下降或协同其他恶性疾病时则迅速发病［1］．故多以免疫抑制剂或切脾手术辅助模型的建立［7］．但是有人认为免疫抑制状态下建立的模型存在缺陷，对其指标进行测定和评价时，不能反映自然发病状态．

2 动物模型的制作

2．1 感染源 附红细胞体动物模型的构建多采用全血或者分离纯化的附红细胞体作为感染源．其中以全血作为感染源建立附红细胞体感染的动物模型存在缺陷，因为采用全血作为感染源有可能将白细胞等其他血液组成一同注入实验动物体内，感染源不单一，会影响实验结果．高娃等［7］采用从自然感染病例中分离纯化附红细胞体作为感染源构建实验动物模型，附红细胞体出现和消失的时间均早于全血组．可在感染3 d后获得较高的感染率．表明以分离纯化的附红体人工感染更科学，模型构建更标准，可重复性更好．余飞等［12］也证明了此观点．

2．2 感染方式 现在实验中采用的感染方式有尾静脉注射、腹腔注射、耳源静脉注射、滴鼻法、皮下注射、肌肉注射等．其中前三种多用．小鼠多采用尾静脉接种法或腹腔接种法 ，如高娃等［7］用尾静脉注射和腹腔接种成功建立小鼠模型．巴彩凤等［13］采用腹腔注射成功建立小鼠模型；家兔多采用耳静脉注射感染动物模型，孙英峰分别采用腹腔、皮下及肌肉感染大鼠，均成功建立了大鼠模型．

2．3 感染剂量 抗凝全血0．5 mL／只，分离纯化的红细胞为100 μL（浓度为：1×107个／μL）．如冯会全［10］、王小飞［14］、周晓敏等［15］分别采用 0．5 mL／只感染小鼠．巴彩凤等［13］采用每只0．5 mL／d．冯会全等［10］5 mL感染SD大鼠．家兔每只接种10 mL血样［3］．每只小鼠接种100 μL纯化的猪附红体悬液［10］．

3 模型的评价指标

3．1 症状观察 症状观察发现动物有食欲减退、精神低靡等症状，高热、黄疸等体征时就要怀疑是附红细胞体感染．需要进一步的辅助检查明确诊断．目前临床观察对该病早期诊断意义不大，只能提供诊断线索．

3．2 显微镜检查

3．2．1 鲜血压片镜检 将采集的血液样品，加等量生理盐水稀释，吸取一滴置于载玻片上，加盖玻片，置于400倍显微镜下观察．判断标准为：镜下观察10个视野，发现血液中有卵圆形、球形、哑铃型、逗点状和杆状小体，具有运动性、折光性［16］等特点的即为附红细胞体．被附着的红细胞由于膜张力作用的改变，形状也发生了变化，呈菠萝、星芒或锯齿等不规则形状的红细胞即为感染阳性．镜下观察红细胞分布区20个视野，若无附红体且红细胞形态正常 ，即为阴性感染［17］．该法简便、直观，但是敏感性差，且存在不科学的地方，所以这种方法观察的结果只能视为疑似病例，不能确诊．

3．2．2 血涂片镜检 用载玻片制成薄而均匀的涂片．革兰氏染色呈阴性．姬姆萨染色时附红细胞体呈淡紫红色、橘黄色，中央发亮，形似空泡，有折光性，其外周有白色光环，细胞变型严重，呈现血溶性星芒状畸形．瑞士染色时游离的红细胞体呈蓝紫色，轮廓清晰，红细胞呈紫红色，细胞边缘和中间有一至数个附红细胞体，形态大小不一．当在1 000倍油镜下观察时，附红细胞体轮廓不清，只见3～8个蓝紫色颗粒，颗粒之间有紫红色基质映衬，附红细胞体在红细胞上像一个个气泡［18］．此法在一般实验室均可操作，是目前普遍采用的快速诊断方法．但由于附红细胞体感染常出现短时间的菌血症，在出现临床症状之前往往看不到附红细胞体［17］．在混合感染和感染后期，由于附红细胞体形态的改变以及其他病原体与之在形态和染色性质上的相似性，仍不能理想的检测和鉴定［18］．

3．2．3 扫描电镜观察 用扫描电镜观察发现，附红细胞体大小不一，形态多样，只寄生在红细胞表面而不进入红细胞内［18］，无核、无细胞器，只有单层膜包裹，其中可见颗粒状物无规则分布在胞浆内［19］．红细胞呈锯齿状或不规则的多边形，局部凹陷，个别膜表面形成洞．但由于附红细胞体的形态多样，其他病原体的混合感染以及一些血液杂质的干扰 ，该方法的检出率仍然很低．

3．2．4 透射电镜 附红细胞体在透射电镜为大小不等的以球形小体为主的多形小体，在少数大型附红细胞体上可见到纤毛［19］．

3．3 血清学检测 血清学检测有间接血凝抑制试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光实验（IFA）等几种方法．其中间接血凝抑制试验（IHA）方法可检测出隐性感染阶段的动物模型．酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于快速诊断，适合群体诊断．免疫荧光实验（IFA）检出率高于普通镜检．

3．4 分子生物学检测 用猪附红细胞体16srRNA基因的三对特异性引物建立的PCR方法具有特异性强、敏感性高等特点，常用来检测动物模型．

4 展望

本文把与附红细胞体病动物模型相关的模型动物的选择、模型制作的方法、模型评价的指标进行了总结．发现关于附红细胞体病动物模型的制作存在动物选择不理想、制作方法不规范、检测指标复杂等问题．因此寻找理想的实验动物、规范的制作方法、简捷的检测方法成为日后附红细胞体病发病机制研究、药物筛选的关键．

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《心血管外科杂志（电子版）》征稿启事

《心血管外科杂志（电子版）》（ISSN：2095-2260 CN：11-9317／R，季刊）由人民军医出版社主办，解放军总医院心血管外科（全军心脏外科研究所）承办，人民军医电子出版社出版；被万方数据库、中国核心期刊（遴选）数据库、中国知网资源总库（CNKI）收录，以光盘（DVD-ROM）附带纸质导读的形式同步发行．

《心血管外科杂志（电子版）》是一本主要报道心血管外科专业以及相关领域学科科研成果的医学学术期刊，以心血管外科医师、麻醉师、体外循环师、心血管重症、放射及超声医师为主要读者对象．

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Research progress on animalmodelof eperythrozoonosis

LIU Huan-Yu，CHEN Yao
Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China

Animal model plays an important role in study of the pathogenesis and drug selection in eperythrozoonosis．The study summarized the researches on the eperythrozoonosis animal model in recent years，and reviewed the selection and establishment of animal model，，aiming lay basis for the further study of eperyth-rozoonosis．

eperythrozoonosis；animal model；study advance-ment

R38

A

2095-6894（2015）05-148-03

2015-04-02；接受日期：2015-04-12

刘寰宇．硕士．

陈 瑶．E-mail：chenyaocy2011＠126．com