MicroRNA在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展△

汤迪 陶磊



·综 述·

MicroRNA在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展△

汤迪 陶磊

MicroRNA(miRNA)是一组内源性非编码小分子RNA，通过转录后水平调控靶基因的表达。近年来发现许多肿瘤的发生与miRNA水平异常有关，本文主要就miRNA在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展进行综述，包括头颈部鳞状细胞癌中miRNA的表达差异、肿瘤发生、发展的分子机制，以及早期诊断、预后评估和靶向治疗的临床应用。

头颈部肿瘤是目前世界上第六大常见肿瘤，最常见的病理类型是鳞状细胞癌(简称鳞癌)，手术、放化疗是主要治疗方式，而患者的5年生存率只有50%，局部复发、颈部淋巴结转移是主要死因[1]。明确头颈部鳞癌发生、发展的分子机制，寻找早期诊断指标，开展有效配合手术的靶向治疗，成为了头颈部鳞癌研究中的热点与难点。有研究[2]表明，MicroRNA(miRNA)参与调节大部分细胞学进程，在肿瘤的发生、发展、预后中起着重要作用。本文主要就miRNA在头颈部鳞癌中的研究进展进行综述。

1 MicroRNA研究概述

1993年，Lee等[3]在秀丽隐杆线虫体内发现了首个能时序调控胚胎后期发育的基因lin-4，研究者相继在果蝇、斑马鱼、小鼠、人类等真核生物细胞中发现了上百个相似的小分子RNA，并将其称为miRNA。在miRBase发布的第20次统计数据中，目前已在206个物种中发现了24 521个miRNA基因位点和30 424种各不相同的成熟miRNA序列[4]。

1.1 miRNA的生物学特性 miRNA是一类高度保守的内源性非编码小分子RNA，长度为20～24个核苷酸，其编码序列大部分位于基因间隔区或蛋白编码基因的内含子区，在细胞核内通过核苷酸聚合酶Ⅱ转录为含有帽子结构和多聚核苷酸尾的pri-miRNA，继而由核酸内切酶RNaseⅢ Drosha和双链RNA结合蛋白DGCRC8/Pasha组成的微处理复合体加工、切割形成pre-miRNA，其5′端具有磷酸基，3′端具有二核苷酸突出茎环，并在转运蛋白Exportin-5和Ran-GTP共同作用下转运至细胞质，经核苷酸内切酶RNaseⅢ Dicer切割生成双链miRNA，其中1条单链为成熟的miRNA。成熟miRNA与一些关键蛋白(如AGO2、GW182)结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，以不完全互补的方式和靶基因mRNA的3′端UTR区结合，抑制靶基因的翻译，从而实现转录后水平负调控靶基因的表达[2]。但近期有研究[5]发现，miR-10a可以通过与核糖体蛋白mRNA5′UTR结合，促使其翻译，提高核糖体的生成，从而正调控蛋白质的总合成量，这一结果表明某些miRNA也可发挥正调控作用。

miRNA通过转录后水平调控靶基因的表达，同一miRNA可以调控多个mRNA，不同的miRNA也可以协同调控同一个mRNA，它们之间构成一个复杂的调控网络，控制细胞及个体的重要生命活动。

1.2 miRNA与肿瘤 既往研究认为编码蛋白的基因异常会导致肿瘤的发生、发展。自从Calin等[6]首次报道与肿瘤相关性miRNA的研究，人们对肿瘤发生的机制有了新的认识。Calin等在对人类慢性淋巴细胞白血病(CLL)进行研究时，发现68%的CLL患者携带miR-15和miR-16表达水平下降的癌细胞。在正常情况下，这2种miRNA可作用于线粒体膜的抗凋亡蛋白Bcl-2并抑制其表达，从而调节细胞凋亡过程。当miR-15和miR-16表达下降时，促使Bcl-2蛋白表达增加，抑制细胞凋亡导致CLL发生。miRNA通过转录后水平调控癌基因、抑癌基因或肿瘤产生途径中重要分子的表达，分别扮演了癌基因和抑癌基因的角色。

2 miRNA在头颈部鳞癌中的差异表达及其机制

Chen等[7]对包括218例头颈部鳞癌样本和125例对照样本在内的13篇相关miRNA表达谱研究文献进行Meta分析，结果显示，有67种miRNA表达一致性差异，其中明显上调的miR-21、miR-155、miR-130b、miR-31、miR-233和明显下调的miR-100、miR-99a、miR-375在进一步的头颈部鳞癌样本和对照样本检测中得到一致结果。随着反转录聚合酶链反应、微阵列芯片等技术的发展与应用，头颈部鳞癌相关miRNA表达谱越来越丰富。

Calin等[8]发现，超过50%的miRNA基因位于肿瘤相关区域，如杂合等位基因丧失区域、癌基因扩增区域、肿瘤基因组断裂点和染色体脆性位点，这些区域是基因缺失、扩增和突变的好发区域，miRNA基因位点与肿瘤基因组易变区域的相关性缺失影响着miRNA的表达水平。再者，miRNA本身受到其他表观学修饰机制的调控。有研究[9]表明，包括头颈部鳞癌在内的多种实体肿瘤，miR-137的表达下调与其甲基化存在着相互关系。此外，miRNA表达水平也与其生物合成障碍有关。肿瘤细胞内Drosha对miRNA初级转录产物加工障碍，从而导致细胞内miRNA表达普遍下调[10]。人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)在头颈部鳞癌发生中的作用已被认同[11]，可通过改变宿主细胞中miRNA的表达水平影响宿主细胞的功能。有研究[12]表明，HPV E6蛋白通过对p53的突变作用，下调miR-34a表达水平，进而提高细胞的增殖能力。

头颈部鳞癌组织来源广泛，而miRNA具有很高的组织特异性，且同一组织不同分化状态下其miRNA也不尽相同，造成了目前缺乏明确统一的特异性miRNA作为头颈部鳞癌的特异性诊断标记物。另外，不同的头颈部鳞癌样本材料来源，如肿瘤细胞系、新鲜冷冻组织、10%甲醛溶液固定后石蜡包埋组织、体液等，可能会造成更大的miRNA表达差异[13]。

3 miRNA在头颈部鳞癌发生、发展中的作用

miRNA对靶基因实行转录后调控，异常的表达上调会抑制抑癌基因的表达，异常的表达下调则不能有效抑制癌基因的表达，从而调控头颈部鳞癌的发生、发展。

3.1 细胞增殖和凋亡 头颈部鳞癌的生长特点是原有正常细胞特性丧失，细胞恶性增殖能力增强，细胞凋亡失控，而miRNA是调节肿瘤细胞增殖和凋亡的重要分子。

有研究[14]表明，miR-21在多种肿瘤组织中表达显著上调，可作用于PTEN基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten)、原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPM1)、程序性细胞死亡基因(programmed cell death 4，PDCD4)等靶基因，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。Kimura等[15]在头颈部鳞癌细胞系和手术样本中均发现miR-21表达显著上调，认为miR-21通过抑制相关mRNAs的表达从而导致凋亡级联事件的阻断。喉癌是最常见的头颈部肿瘤之一，绝大多数为鳞癌。Liu等[16]发现，miR-21在喉癌Hep-2细胞中高表达，敲除miR-21后肿瘤细胞集落较未敲除组明显减少，出现G1-S停滞现象。B细胞异位基因(B-cell translocation gene 2，BTG2)作为一个全细胞周期调节因子，是miR-21的作用靶基因之一，通过抑制细胞周期蛋白D1的表达和周期素依赖蛋白激酶4蛋白的合成，诱导G1-S期阻滞。异常高表达的miR-21抑制BTG2对G1-S期的阻滞作用，使喉癌细胞的增殖能力增强。当miR-21的抑制作用解除后，BTG2开始发挥对细胞周期的阻滞作用，缺失由G1到S期的转换调控，从而控制肿瘤细胞的恶性增殖。随着研究的深入，越来越多的miRNA分子被发现在调节细胞增殖和凋亡中有着重要作用。

3.2 细胞侵袭与转移 侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特性，头颈部鳞癌细胞转移往往导致患者预后差、生存率低。miRNA作为一种间接调控因子可参与多种靶基因的调节，参与肿瘤的侵袭与转移。

上皮细胞向间充质细胞转变(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)的发生，很大程度地提高了恶性肿瘤细胞的侵袭力和转移性。有研究[17]表明，头颈部鳞癌中mi-R133表达水平的下调可以通过作用于微囊蛋白1(caveolin-1，CAV1)、肌钙蛋白3[18](tropmysin，TPM3)等靶基因诱导EMT的发生，促进肿瘤转移。

Wu等[19]发现，在喉癌Hep-2细胞中高表达的miR-16作用于斑联蛋白，降低细胞之间的黏附，提高癌细胞的迁移能力，促进喉癌的侵袭。Liu等[20]发现，口腔鳞癌患者高表达的miR-31可通过降低低氧诱导因子抑制因子(FIH)的表达，间接激活低氧诱导因子(HIF)信号通路，从而诱导血管、淋巴管的生成，促进肿瘤的侵袭和转移。

4 miRNA在头颈部鳞癌的临床应用

异常表达的miRNA不仅可以应用于头颈部鳞癌的早期诊断，而且对于肿瘤转移和预后监测也具有一定的指导意义，并为靶向治疗提供了新思路。

4.1 早期诊断 分析头颈部鳞癌、癌前病变、正常组织差异表达的miRNA，有助于早期诊断或辅助判定头颈部鳞癌癌前病变的恶性转变。Cervigne等[21]通过对非进展性黏膜白斑、进展性黏膜白斑及浸润型口腔鳞癌患者定期检测miRNA表达水平，比较不同病变进展期内miRNA的表达差异，结果发现约有109种miRNA在进展性黏膜白斑及浸润型口腔鳞癌中过度表达，其中miR-21、miR-181b和miR-345表达水平与病变进展程度明显正相关，表明这3种miRNA在肿瘤形成过程中发挥着重要作用。通过比较癌前病变与头颈部鳞癌组织中差异表达的miRNA，不仅可以了解该miRNA在头颈部鳞癌发展过程中的作用，而且可以辅助判定头颈部鳞癌癌前病变的恶性转化，为疾病进展的预测提供可靠依据，进而对癌前病变进行合理的治疗。

4.2 预后评估 淋巴结转移与否对头颈部鳞癌患者的预后具有重要影响，而淋巴结转移病理分期常因微小转移灶等因素而具有一定难度。Fletcher等[22]采用定量反转录聚合酶链反应检测5例良性病变淋巴结和8例病理证实头颈部鳞癌阳性转移淋巴结的miR-205表达情况，结果显示临床病理阳性转移淋巴结中miR-205明显高表达，而良性病变淋巴结几乎无表达，可以将阳性转移淋巴结与良性病变淋巴结区别开来，并将miR-205作为鳞状上皮特异性表达的miRNA。研究者继而用上述方法对细胞培养的淋巴组织模型检测，结果在106个淋巴细胞中检测到一个鳞状细胞，进一步证实该方法在检测鳞状上皮来源的组织具有极高的敏感度。此法有望成为一种新的评估头颈部鳞癌淋巴结转移的分子标志物，从而避免对无淋巴结转移患者的过度治疗。

4.3 靶向治疗 miRNA作为一种表观遗传修饰，其改变具有可逆性。当具有抑癌基因功能的miRNA表达下调时，可以通过外源性补充相应前体及类似物进行替代治疗，增强其功能从而抑制肿瘤生长；当具有癌基因功能的miRNA表达上调时，可以通过miRNA抑制物调节靶mRNA及其蛋白的表达水平，从而控制肿瘤恶性增殖和促进细胞凋亡。

Cai等[23]发现，miR-34c在喉鳞癌细胞中表达下调，通过反转录病毒载体将miR-34c转导入Hep-2细胞内，发现该miRNA分子可以显著抑制Hep-2细胞的生长和侵袭能力，预示 miR-34c 可以成为临床治疗的潜在靶点。

化疗是头颈部肿瘤的治疗手段之一，但肿瘤细胞多重耐药性仍是化疗失败的主要原因。Yu等[24]发现，在对顺铂产生耐药性的口腔鳞癌细胞系中，miR-23a、miR-214表达上调，miR-21表达下调。当miR-23a、miR-214表达失活和miR-21表达复苏后，该口腔鳞癌细胞系对顺铂的耐药性减弱，这预示着miRNA在抑制肿瘤细胞耐药性、提高头颈部鳞癌对化疗药物敏感度等方面发挥一定作用。

5 展望

目前对于miRNA的研究尚存在很多挑战。至今缺乏明确的特异性miRNA作为头颈部鳞癌的特异性诊断标记物，miRNA在头颈部鳞癌发生、发展的各个阶段起关键性作用的分子机制也尚不清楚，例如，miRNA表达水平的变化是如何开始和维持？miRNA和目前已知的各种癌基因、抑癌基因、信号通路等是如何相互作用？表达差异的miRNA哪些是“致癌因素”？哪些是“从属变化”？由于单个miRNA表达变化可以改变下游许多靶基因的表达，如何改善治疗的靶向性、减少副反应的发生成为了治疗难点。此外，目前研究多停留在以头颈部鳞癌细胞系为实验模型的试验阶段，如何将实验结果应用于临床，需要更深入的研究。

[ 1 ] Bose P, Brockton NT, Dort JC. Head and neck cancer: from anatomy to biology[J]. Int J Cancer, 2013, 133(9): 2013-2023.

[ 2 ] Jansson MD, Lund AH. MicroRNA and cancer[J]. Mol Oncol, 2012, 6(6): 590-610.

[ 3 ] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854.

[ 4 ] Kozomara A, Griffiths JS. miRBase: annotating high confidence microRNAs using deep sequencing data[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42: 68-73.

[ 5 ] Orom UA, Nielsen FC, Lund AH. MicroRNA-10a binds the 5'UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation[J]. Mol Cell, 2008, 30(4): 460-471.

[ 6 ] Calin GA, Dumitru CD, Shimizu M, et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002，99(24): 15524-15529.

[ 7 ] Chen Z, Jin Y, Yu D, et al. Down-regulation of the microRNA-99 family members in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol, 2012, 48(8): 686-691.

[ 8 ] Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004， 101(9):2999-3004.

[ 9 ] Langevin SM, Stone RA, Bunker CH, et al. MicroRNA-137 promoter methylation is associated with poorer overall survival in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Cancer, 2011, 117(7): 1454-1462.

[10] Thomson JM, Newman M, Parker JS, et al. Extensive post-transcriptional regulation of microRNAs and its implications for cancer[J]. Genes Dev, 2006, 20(16): 2202-2207.

[11] Chow LT, Broker TR, Steinberg BM. The natural history of human papillomavirus infections of the mucosal epithelia[J]. APMIS, 2010, 118(6/7): 422-449.

[12] Wang X, Wang HK, McCoy JP, et al. Oncogenic HPV infection interrupts the expression of tumor-suppressive miR-34a through viral oncoprotein E6[J]. RNA, 2009, 15(4): 637-647.

[13] Janiszewska J, Szaumkessel M, Szyfter K. microRNAs are important players in head and neck carcinoma: a review[J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2013, 88(3): 716-728.

[14] Pan X, Wang ZX, Wang R. MicroRNA-21: a novel therapeutic target in human cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2010, 10(12): 1224-1232.

[15] Kimura S, Naganuma S, Susuki D, et al. Expression of microRNAs in squamous cell carcinoma of human head and neck and the esophagus: miR-205 and miR-21 are specific markers for HNSCC and ESCC[J]. Oncol Rep,2010, 23(6): 1625-1633.

[16] Liu M, Wu H, Liu Y, et al. Regulation of the cell cycle gene, BTG2, by miR-21 in human laryngeal carcinoma[J]. Cell Res, 2009, 19(7): 828-837.

[17] Nohata N, Hanazawa T, Kikkawa N, et al. Caveolin-1 mediates tumor cell migration and invasion and its regulation by miR-133a in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2011, 38(1): 209-217.

[18] Kinoshita T, Nohata N, Fuse M, et al. Tumor suppressive microRNA-133a regulates novel targets: moesin contributes to cancer cell proliferation and invasion in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 418(2): 378-383.

[19] Wu H, Liu T, Wang R, et al. MicroRNA-16 targets zyxin and promotes cell motility in human laryngeal carcinoma cell line Hep-2[J]. IUBMB Life, 2011, 63(2): 101-108.

[20] Liu CJ, Kao SY, Tu HF, et al. Increase of microRNA miR-31 level in plasma could be a potential marker of oral cancer[J]. Oral Dis, 2010, 16(4): 360-364.

[21] Cervigne NK, Reis PP, Machado J, et al. Identification of a microRNA signature associated with progression of leukoplakia to oral carcinoma[J]. Hum Mol Genet, 2009, 18(24): 4818-4829.

[22] Fletcher AM, Heaford AC, Trask DK. Detection of metastatic head and neck squamous cell carcinoma using the relative expression of tissue-specific mir-205[J]. Transl Oncol, 2008, 1(4): 202-208.

[23] Cai KM, Bao XL, Kong XH, et al. Hsa-miR-34c suppresses growth and invasion of human laryngeal carcinoma cells via targeting c-Met[J]. Int J Mol Med, 2010, 25(4): 565-571.

[24] Yu ZW, Zhong LP, Ji T, et al. MicroRNAs contribute to the chemoresistance of cisplatin in tongue squamous cell carcinoma lines[J]. Oral Oncol, 2010, 46(4): 317-322.

(本文编辑 杨美琴)

国家自然基金青年基金(30801283)；上海市科委青年科技启明星(09QA1401000)；上海市卫生局优青计划项目(XYQ2011055)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科 上海 200031

陶磊(Email：doctortaolei@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.02.020

2014-03-21)