微小RNA与心房颤动心肌重构的研究进展

龙秀环 徐新 张社兵

综 述

微小RNA与心房颤动心肌重构的研究进展

龙秀环 徐新 张社兵

作者单位：512026 广东省韶关市，汕头大学医学院附属粤北人民医院心血管内科

心房颤动； 微小RNA； 心肌电重构； 心肌结构重构； 心肌纤维化

心房颤动（atrial fibrillation，简称房颤）是临床上最常见的心律失常之一。近来一项关于心房颤动危险因素的回顾性研究指出，高龄、吸烟、肥胖、高血压、左心房扩大、左室射血分数减低等容易促进房颤的发生[1]。中国的房颤流行病学调查显示，我国目前房颤患病率为0.77%，根据我国标准人口构成校正后为0.61%，若按目前我国13亿人口计算，我国房颤人数接近800万[2]。房颤可以造成心排血量减少、心室率过快或过慢，可加重心肌缺血及恶化心功能，此外房颤所致附壁血栓脱落还可引起体循环栓塞等严重心脑血管事件发生。在美国15%～25%的脑卒中是由房颤导致的[3]。与非房颤患者相比，房颤患者有4～5倍的卒中风险、2倍左右的痴呆风险、3倍左右的心衰风险，全因死亡可升高40%～90%[4,5]。房颤及其并发症极大地威胁着人们的健康，并造成了巨大的社会经济负担。然而房颤的确切发病机制并不十分清楚，临床治疗效果仍不理想，因此从房颤的发生及维持机制方面入手，寻找预防和治疗房颤的新方法、新手段势在必行。

微小 RNA（microRNA，miRNA or miR)是新发现的一类高度保守的内源性非编码小RNA，是基因表达转录后调节的重要分子，能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控[6]。MiRNA通过对编码心房肌电重构与结构重构基因调节，参与房颤的发生与维持。

1 心房颤动的发生机制

房颤的发生机制存在许多不同假说，如折返假说[7,8]、多重微波假说[9]等，但基于这些假说所研制的药物尚不能安全有效治愈房颤，根据抗心律失常药物作用最佳靶点学说[10]，房颤尚有重要的潜在靶点未被发现。

目前认为在心房颤动发生过程中，主要有两种心房重构类型参与其中：即心房电重构（atrial electrical remodeling，AER）[11]和心房结构重构（atrial structural remodeling，ASR）[12]。多数情况下，心房结构重构为心房电重构的基础，二者亦可相互结合、相互影响，成为心房颤动的电生理、解剖学基础。

1995年，Wijffels等[13]最先提出“电重构”这一概念。心房电重构其本质是离子通道的改变，后者引起有效不应期（ERP）和动作电位时程（APD）进行性缩短，传导速度减慢，ERP频率适应性降低，空间不均一性增高和房内折返波长缩短，使房颤更容易导致房颤，即房颤致房颤。

1995年，Morillo等[14]首先发现房颤时心房肌细胞超微结构的改变。心房的结构重构主要表现为心肌间质重构和心肌细胞结构改变，心房间质纤维化是由于心房成纤维细胞形成和细胞间质胶原沉积的增加所致[15]。多种机制参与了房颤的心肌结构重构的改变，但是在不同的条件下，只是一种机制起主导作用。房颤发生心房结构重构机制可能包括：心房肌局部肾素-血管紧张素系统（RAS）激活，转化生长因子（TGF）β、缝隙连接蛋白（Cx）、基质金属蛋白酶（MMP）、炎症因子（如 CRP、IL-1、IL-6、C3等）、通道和受体蛋白等变化[16]。

2 MiRNA的发现与生成

1993年，Lee等[17]在对秀丽新小杆线虫研究中首次发现miRNAs，并将其命名为lin-4。这是一个长度约为22核苷酸（nt）的非编码单链RNA。随后大量的实验证明，miRNAs可以广泛而稳定地存在于人类细胞外液，包括血清、血浆和组织中，参与包括大脑、肺脏、心脏、骨骼肌、肝细胞和其他组织的发育过程。机体发生不同疾病时，miRNA随之发生相应改变。近年来发现，miRNA与心律失常，尤其与心房颤动的发生发展密切相关。MiRNA可通过对靶基因表达水平调控积极参与心肌组织的电重构和结构重构。

MiRNAs主要位于染色体基因之间非编码区域的序列，miRNA在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录生成较大的初级miRNA（primary miRNA，pri-miRNA），pri-miRNA片段较长，通常有几百至一千nt，含有帽子和polyA尾巴结构，二级结构呈特殊的发夹状茎环。随后在Drosha酶的作用下生成60～70 nt的发夹状、部分互补的单链前体miRNA（precursormiRNA，pre-miRNA），在核输出因子的作用下进入细胞质中，并在Dicer酶的作用下剪切成为非成熟的双链miRNA，然后解旋成为单链成熟的miRNA，miRNA与RNA诱导的沉默复合物（RISC）形成复合体后通过与靶mRNA的3′UTR区不完全互补结合，通过抑制mRNA编码蛋白质的翻译过程来调控基因表达。

3 MiRNA与心房电重构

心脏电信号传导的基础是心肌细胞跨膜离子通道电流。心肌细胞膜上存在多种离子通道，如IK、ICa、INa等，这些通道顺序开放以及表达和功能的动态平衡是心脏维持正常功能的基础。当某种通道的功能或表达异常时，通道间的平衡被打破，将出现心律失常。一些心律失常易感因素可通过影响钠、钾、钙等离子通道功能，引起离子通道间平衡失调，导致心肌电信号传导紊乱，诱发心律失常的发生[18]。

在一个开创性的研究中发现，房颤患者心肌组织中miRNA-1的表达水平下降86%。已证实miRNA-1通过靶向通道Ik1和连接蛋白43使心房颤动病理生理变化[19]，同时也证明心脏传导性在房颤诱发中占主导地位[20,21]，但这与Yang等[22]研究发现miRNA-1在室性心律失常中表达上调的结果不一致。最近还有研究[23-26]提出，miRNA-1可通过调节Ca2+通道的蛋白质表达水平，包括钙调磷蛋白、钙磷受调蛋白、钠钙离子交换体蛋白（NCX）、钙结合蛋白、连接素等改变，最终导致肌浆网Ca2+释放减少。这进一步证明miRNA-1在房颤的电重构中发挥着重要作用。

近来研究发现，慢性房颤患者心肌细胞中表达上调的miRNA-21，可引起一种电压依赖性钙通道的亚基蛋白表达下调，特别是亚基1αC（CACNA1C）和 β2（CACNB2），导致 L-型钙电流减少，从而形成心肌纤维化，参与房颤的心肌电重构[27]。

据报道，在房颤患者及动物模型中miRNA-26表达水平下调，通过调控其靶基因Kir2.1表水平诱导Ik1表达失调，这与房颤易感性相关。有趣的是，房颤诱发模型中miRNA-26表达减少可由Ca2+依赖性的转录因子和活化T细胞的核因子（NFAT）介导[28]。

Lu等[29]通过microRNAs表达谱芯片筛查风湿性心脏病合并房颤患者及心房快速起搏致犬房颤模型，发现 miRNA-223、miRNA-328、miRNA-664表达水平较对照组增高2倍以上，而miRNA-101、miRNA-320、miRNA-499则下调接近50%。其中以miRNA-328表达异常最为明显，其在房颤患者中表达增高3.5倍，在犬房颤模型中增高3.7倍，进一步通过靶基因预测及细胞学研究证实miRNA-328靶基因是CACNA1C和CACNB1，并可通过调控L型Ca2+通道的两种亚基蛋白，对L型Ca2+通道产生影响达到缩短动作电位时程，导致心肌电重构发生改变，从而参与房颤的发生与维持。最近有研究[30]证实了miRNA-328对调节Ca2+通道表达水平的重要性，随着miRNA-328过表达，SERCA2a表达水平下降，使细胞内钙浓度增加和钙调神经磷酸酶蛋白表达水平升高。

MiRNA-133是肌肉特异性的miRNA，是调节心肌离子通道的一个重要因子。将外源miRNA-133导入兔肌细胞和H9c2细胞系，可引起KCNH2基因发生转录后抑制，而KCNH2基因编码的ERG蛋白导致IK通道发生改变，其中IK是人类心肌细胞主要的复极化离子流[31]。MiRNA-133的QT间期延长效应在Matkovich等[32]的研究中也被证实了，miRNA-133a水平增高可以延长QT间期，在小鼠体表心电图记录以及分离的心室肌细胞的肌动作电位时程（APD）中都有反映。还可以监测到快速代偿性外向钾离子流减弱。编码KvLQT1钾离子通道（慢速延迟整流钾离子流）亚单位的KCNQ1基因也是miRNA-133的靶点[33]。另外，在应用Ikr阻滞剂多非利特的犬心室细胞中可以观察到miRNA-133表达水平下调伴随着KvLQT1/Ikr上调，这证明离子通道表达存在反馈调节机制。Ikr功能增强可以使心房APD缩短，这是部分家族性房颤的病因[34]。这些显示了miRNA-133表达水平下调可以缩短APD、抑制KCNH2/ERG/Ikr及KCNQ1/KvLQT1/Iks从而影响心肌电生理活动。

最近Ling等[35]发现，心房颤动患者心房组织中表达上调的miRNA-499与KCNN 3有着密切关系，被认为通过调节KCNN 3编码SK3蛋白表达水平参与房颤的心肌电重构，将miRNA-499转染至HL-1细胞株后可以抑制SK3蛋白表达；反之抑制miRNA499表达能够使SK3蛋白表达水平上调。显然，miRNA-499通过介导KCNN3/SK3表达诱导房颤。

4 MiRNAs与心房结构重构

心脏结构重构的重要标志是心肌纤维化，后者主要表现为间质中胶原合成增加，各型胶原比例失调、排列紊乱，最终引起心房功能下降。房颤患者的心脏已被证实在心肌细胞和细胞外基质（ECM）水平上发生结构重构，主要包括Ⅰ、Ⅲ型胶原，纤维连结蛋白，层粘连蛋白，纤维调节素，副层黏蛋白等变化[36]。在心脏病发生发展过程中ECM的变化是对心肌重构及功能改变的一种病态反应[37]。

MiRNA-1不仅在心脏的电重构中调节重要通道蛋白表达水平的变化，还通过调节靶蛋白Fibullin-2表达水平引起细胞外基质的重塑，导致心肌纤维化，使心脏产生结构重构变化，从而参与房颤的发生[38]。

在房颤患者及小鼠动物模型中心房组织的miRNA-21表达均升高，miRNA-21及其下游的靶蛋白Spry1主要通过调节成纤维细胞的存活及生长因子的分泌控制间质纤维化程度，从而参与心房结构重构变化[39,40]。最近一项研究表明，miR-21表达水平上调可抑制DUSP8蛋白表达水平，后者对JNK和p38丝裂原活化蛋白激酶进行负性调节，促进心脏成纤维细胞胶原合成，形成心肌纤维化[41]。

Duisters等[42]在左心室肥厚纤维化组织中发现miRNA-30和miRNA-133表达水平均明显降低，使结缔组织生长因子（CTGF）表达水平升高，从而促进胶原蛋白合成，参与心肌纤维化的形成。近来有研究进一步证实，在房颤患者中下调的miRNA-30和miRNA-133可直接与结缔组织生长因子（CTGF）蛋白3′非编码区相互作用，导致细胞凋亡、心肌纤维化[43-45]。

研究显示，miRNA-590通过引起心房结构重塑（A-SR）促进房颤发生[46]。在体外培养的犬心房成纤维细胞及犬体内快速心房起搏诱导的房颤标本中都证实，在尼古丁刺激作用下心房可产生大量的胶原产物并发生心房纤维化，经尼古丁处理后的心肌低表达miRNA-133和miRNA-590可使转化生长因子 β1（TGF-β1）和 TGF-β1 受体Ⅱ（TGFBRⅡ）蛋白表达上调[33]，将miRNA-133或miRNA-590转染至培养的心房成纤维细胞中可以减少TGF-β1和 TGFBRⅡ蛋白水平以及胶原含量。MiRNA-133或miRNA-590的反义寡核苷酸链可以阻止尼古丁的这些效应。这说明在犬心房中尼古丁诱导的心肌纤维化是通过下调抗纤维化的miRNA（miRNA-133和miRNA-590）表达水平来实现的。

Dawson等[47]房颤合并充血性心力衰竭（CHF）犬模型研究报道了miRNA-29b主要靶基因是ECM编码基因，如COL1A1、COL3A1和FBN（编码原纤维蛋白）。这项研究在CHF成纤维细胞中发现低表达的miRNA-29b可引起其靶基因表达上调，使纤维蛋白表达水平升高，促进纤维化的形成，导致心肌结构发生改变。

除了上述microRNAs外，miRNA-29通过调节特定的蛋白参与心肌纤维化和细胞凋亡，从而诱发房颤[48,49]。另有研究[50]发现，miRNA-432在心房颤动患者血浆中表达下调，通过miRNA靶基因预测软件联合推测miRNA-432可能通过调节靶基因CDKN2B，影响信号通路中转化生长因子β1的表达水平，导致心肌纤维化，参与心房颤动的发生与维持，而microRNA-432与TGF-β1的关系需进一步研究证实。

5 结论

越来越多证据表明，miRNAs在多种疾病的发生发展中占据重要的地位，包括心房颤动的发生与维持，这将是生物学中最重要的研究领域之一。心房颤动中不同miRNAs相对作用有可能取决于房颤的潜在病因，如节律多于终末阶段发生病理改变从而诱发心房颤动。在心脏电重构和结构重构中的miRNAs直接或间接作用于基因转录后水平，表明miRNAs可以作为心房颤动的生物学标志物，或者促进心房颤动预防、治疗、防止复发相关方面药物靶向治疗的发展。

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The research progress of microRNAs and atrial fibrillation

Atrial fibrillation； MicroRNA（miRNA）； Electrical remodeling； Structural remodeling； Fibrosis

徐新，E-mail：03xuxin@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．04．002

R541.7

A

1672-5301（2015）04-0293－05

2014-12-12）