CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌淋巴结转移中的作用及意义

李利义 罗越 刘海斌 韩绍伟 王飞海 郑志强

CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌淋巴结转移中的作用及意义

李利义 罗越 刘海斌 韩绍伟 王飞海 郑志强

目的 探讨趋化性细胞受体因子4（CXCR4）、血管内皮生长因子-C（VEGF-C）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在胃癌淋巴结转移中的作用及意义。方法 应用免疫组化法检测76例人胃癌组织中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表达水平，并分析其与胃癌淋巴结转移的关系。结果 CXCR4、VEGF-C或MMP-9任一指标表达水平与胃癌淋巴结转移均有显著关系（均P＜0.01），且这3项指标两两相关，CXCR4/VEGF-C联合阳性表达的患者淋巴结转移率为84.8%（28/33），高于仅1项指标阳性表达（11/22，50.0%）及两者联合阴性表达（7/21，33.3%）的患者，差异有统计学意义（均P＜0.01）；VEGF-C/MMP-9联合阳性表达的患者淋巴结转移率为80.0%（32/40），高于仅1项指标阳性表达（9/19，47.4%）及两者联合阴性表达（5/17，29.4%）的患者，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）；CXCR4/MMP-9联合阳性表达的患者淋巴结转移率为83.3%（30/36），高于仅1项指标阳性表达（11/22，50.0%）及两者联合阴性表达（5/18，27.8%）的患者，差异均具有统计学意义（均P＜0.01）。3项指标共同表达的患者淋巴结转移率高达90.0%。结论 CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌组织中的表达与淋巴结转移关系密切，如果3项指标均为阳性者淋巴结转移的可能性最大。

趋化性细胞受体因子4 血管内皮生长因子-C 质金属蛋白酶-9 胃癌 淋巴结转移

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，居人类肿瘤相关致死率第2位[1]。复发和转移是胃癌患者死亡最主要的原因，其中淋巴结转移是最常见的转移方式，有研究证实淋巴结转移是胃癌患者预后的独立危险因素[2]。趋化性细胞受体因子4（chemokine CXC receptor 4，CXCR4）及其配体CXCLl2所构成的信号传导通路在调节血细胞产生、造血细胞迁移及新生血管形成方面发挥了重要作用，与肿瘤特异性转移密切相关[3-5]。血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）可以促进新生血管形成，而且可以促进淋巴管内皮细胞增殖分化并诱导淋巴管生成。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一种能降解细胞外基底膜及其它细胞外基质成分的重要蛋白酶，具有促进肿瘤浸润和转移的作用。为此，本研究应用免疫组化方法检测人胃癌组织中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表达水平，分析CXCR4、VEGF-C和MMP-9与胃癌淋巴结转移的关系，探讨它们在胃癌淋巴结转移中的作用，以及三者表达的相关性和临床意义。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2009年12月至2010年12月在我院外科行手术治疗的76例胃癌患者的手术切除组织标本；患者中男52例，女24例，年龄26～79岁，中位年龄60岁；所有患者术前均经病理学检查证实，均未接受放疗或化疗。肿瘤分期采用2010年国际抗癌联盟颁布的胃癌TNM分期标准。每例患者于术后10min内取组织标本，包括肿瘤组织及正常胃黏膜组织（距肿瘤组织边缘5cm以上），并迅速置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 试剂 兔抗人VEGF-C试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品，鼠抗人CXCR4抗体购自美国Sigma公司，兔抗人MMP-9抗体购自美国Epitomics公司，免疫组化S-P试剂盒购自德国宝灵曼公司。

1.3 方法 采用S-P法进行免疫组化染色。所有标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋后制备5μm厚连续切片。石蜡切片脱蜡，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明封片，显微镜下观察，操作过程中严格质控。用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断 在组织切片中CXCR4、VEGF-C和MMP-9阳性细胞主要表现为细胞质或(和)细胞膜染为棕黄色。免疫染色的结果由病理科医生判定，每个样本采用双盲法计数10个高倍视野，评估阳性细胞率。阳性细胞数＜10%为阴性，≥10%为阳性，同时忽略较弱或可疑的染色。

1.5 统计学处理 使用SPSS16.0统计软件。率的比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关。

2 结果

2.1 CXCR4、VEGF-C或MMP-9单一表达与胃癌淋巴结转移的关系 76例胃癌患者中无淋巴结转移30例，有淋巴结转移46例，CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌组织中免疫组化染色阳性表达见图1。CXCR4、VEGFC或MMP-9表达与胃癌淋巴结转移的关系见表1。

图1 CXCR4（a）、VEGF-C（b）或MMP-9（c）在胃癌组织中阳性表达（免疫组化染色，×400）

表1 CXCR4、VEGF-C或MMP-9表达与胃癌淋巴结转移的关系[例（%）]

由表1可见，在CXCR4、VEGF-C或MMP-9阳性表达的患者中，淋巴结转移的发生率明显高于阴性表达的患者（均P＜0.01），说明CXCR4、VEGF-C或MMP-9阳性表达与胃癌淋巴结转移有关。

2.2 CXCR4、VEGF-C和MMP-9联合表达与胃癌淋巴结转移的关系 见表2。

由表2可见，CXCR4和VEGF-C均阳性表达的患者中，淋巴结转移的发生率明显高于该2项指标均阴性表达的患者；与仅有1项指标阳性表达的患者相比，淋巴结转移的发生率也明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。同样，VEGF-C和MMP-9或CXCR4和MMP-9均阳性表达的患者中，淋巴结转移的发生率均明显高于该2项指标均阴性或仅有1项指标阳性表达的患者（P＜0.05或0.01）。这一结果提示，3项指标中任意2项阳性表达与胃癌淋巴结转移有关。进一步对CXCR4、VEGF-C和MMP-9这3项指标进行联合分析，46例有淋巴结转移的患者中，仅1项指标阳性表达的患者有5例，2项指标阳性表达的患者有12例，3项指标均阳性表达的患者有27例（90.0℅），3项指标均阴性表达的患者有2例，而在30例无淋巴结转移的患者中，3项指标均阳性表达的患者仅有3例（10.0℅）；3项指标均阳性表达的患者其淋巴结转移的发生率明显高于非3项指标均阳性表达的患者（P＜0.01）。以上结果表明：相比于0、1或2项指标阳性表达，3项指标共同阳性表达与胃癌淋巴结转移的关系更为密切。

表2 CXCR4、VEGF-C和MMP-9联合表达与胃癌淋巴结转移的关系[例（%）]

2.3 CXCR4、VEGF-C和MMP-9表达的相互关系 相关性分析显示，胃癌组织中CXCR4的阳性表达与VEGF-C、MMP-9的阳性表达均呈显著正相关（r=0.355、0.384，均P＜0.01），VEGF-C的阳性表达与MMP-9的阳性表达也呈显著正相关（r=0.278，P＜0.05）。提示在胃癌的发展过程中，CXCR4、VEGF-C和MMP-9的高表达具有协同促进作用。

3 讨论

淋巴结转移是胃癌最主要的转移途径，并且是胃癌患者预后的独立危险因素。因此，研究淋巴结转移的分子机制，控制淋巴结转移，成为胃癌治疗的重要环节，也可能为胃癌的药物治疗研究提供新的靶点。

CXCR4信号通路通过引导趋化和侵袭反应在肿瘤转移中起到了至关重要的作用[6]。VEGF-C是肿瘤血管生成的重要调控因子[7]，并且可以通过与淋巴管内皮细胞上的VEGF受体结合，增加淋巴管的通透性，促进淋巴细胞的增生，诱导淋巴管的生成[8]。MMP-9可以降解肿瘤的细胞外基质，破坏基底膜，促进新生血管生成。基底膜的降解和新生血管的形成共同促使肿瘤细胞进入循环，通过CXCR4-CXCLl2生物学轴的趋化作用，使肿瘤细胞在靶器官被俘获，在靶器官再通过VEGF和MMP-9引起血管新生、基底膜降解，并协同其他因子最终导致肿瘤的转移。

本研究通过免疫组化方法分析了胃癌中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表达情况，结果发现CXCR4、VEGF-C或MMP-9的阳性表达与胃癌淋巴结转移显著相关。进一步研究表明，联合评估这些标记物的表达可能可以用于预测胃癌患者的淋巴结转移情况。

最近的研究证实：通过CXCL12刺激趋化因子受体CXCR4表达或通过转导，使人类肿瘤细胞系CXCR4过表达，可以增加VEGF的异常表达和新生血管形成[9-10]。趋化因子受体CXCR4与其配体CXCL12相互作用，然后通过诱导VEGF介导的血管再生可能促进肿瘤进展和转移。由此我们推断：CXCR4和VEGF的表达水平可能是合适的预测肿瘤细胞转移能力的生物学指标。在本研究中，我们发现胃癌中CXCR4和VEGF-C的表达具有显著相关性。此外，与仅1项指标阳性表达的患者相比，CXCR4和VEGF-C联合阳性表达的患者淋巴结转移率明显增加，差异有统计学意义。因此，CXCR4和VEGF-C表达的变化可能在胃癌淋巴结转移中发挥重要的作用。

由CXCL12-CXCR4轴介导的癌细胞至靶器官的趋化作用需要细胞迁移通过基底膜，但CXCL12和CXCR4不能单独介导这一过程。有趣的是，MMP-9在细胞外基质降解及促进内皮细胞迁移通过基底膜的过程中能发挥重要的作用[11]。体外试验表明：CXCL12-CXCR4相互作用可以增加多种肿瘤细胞系MMP-9的分泌，包括头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌和前列腺癌[12-13]。在本研究中，我们发现胃癌组织中CXCR4和MMP-9的表达显著相关，表明CXCR4的异常表达可能导致胃癌中MMP-9的超表达。我们还发现，与单一指标阳性表达的患者相比，CXCR4和MMP-9联合阳性表达的患者淋巴结转移率显著增加。这一证据表明，CXCR4和MMP-9的联合表达至少在一定程度上可能导致胃癌淋巴结转移，但需要更多的研究来分析CXCR4介导的信号通路导致MMP-9激活的机制，以及它们在胃癌发展中的协同作用。

Sweeney等[143]利用特定抗VEGF抗体治疗前列腺癌小鼠模型，发现其内皮细胞中MMP-9的产生明显减少，因此我们推断：MMP-9与VEGF的表达有内在联系。本研究结果显示，胃癌中VEGF-C和MMP-9的表达有显著的相关性；VEGF-C和MMP-9联合阳性表达的患者淋巴结转移率显著增加。以上结果提示VEGF-C和MMP-9在介导胃癌的淋巴结转移方面具有协同效应，其联合表达可能是胃癌淋巴结转移的重要预测指标。

总之，目前的研究表明CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌组织中高度表达[15]，而且它们的表达具有显著相关性。任一指标的独立表达与胃癌进展相关，3项指标中的任意2项联合表达与淋巴结转移显著相关；与0、1或2项指标阳性表达相比，3项指标共同表达与胃癌淋巴结转移的关系更为密切。因此，CXCR4、VEGF-C和MMP-9共同表达可能是胃癌患者淋巴结转移的有价值的预测指标，三者的协同作用可能促进肿瘤血管生成和淋巴结转移，抑制三者的表达可能是胃癌一种有效的辅助治疗方法。

[1]Jemal A,Bray F,Center M M,et a l.G loba l cancer statistics[J]. CA Cancer JClin,2011,61:69-90.

[2]DegiuliM,BorasiA,Forchino F,etal.Lym ph-nodal ratio in gastric cancer staging system[J].Minerva Chir,2011,66(3):177-182.

[3]Kucia M,Reca R,M iekus K,etal.Trafficking of norm alstem cells and metastasis of cancer stem cells involve sim ilarm echanisms: p ivotalrole of the SDF-1-CXCR4 axis[J].Stem Cells,2005,23(7): 879-894.

[4]Xiang Z,Zeng Z,Tang Z,et al.Increased exp ression of vascular endothelia lg row th factor-C and nuc lear CXCR4 in hepatocellular carcinoma is correlated w ith lymph node metastasis and poor outcome[J].Cancer J,2009,15(6):519-25.

[5]Mukherjee D,Zhao J.The Role of chemokine recep tor CXCR4 in b reastcancerm etastasis[J].Am JCancer Res,2013,3(1):46-57.

[6]Müller A,Homey B,Soto H,et al.Involvementof chem okine recep tors in b reast cancermetastasis[J].Nature,2001,410:50-56.

[7]Ellis L M,Liu W,Fan F,et al.Role of angiogenesis inhibitors in cancer treatment[J].Onco logy(Williston Park),2001,15:39-46.

[8]He Y,Karpanen T,Alitalo K.Ro le of lymphangiogenic factors in tumormetastasis[J].Biochim ica Biophys Acta,2004,1654(1):3-12.

[9]Yang S X,Chen JH,Jiang X F,etal.Ac tivation of chemokine recep tor CXCR4 in m alignantg liom a cells p romotes the p roduction of vascular endothelial g row th factor[J].Biochem Biophys Res Comm un,2005,335:523-528.

[10]Kryczek I,Lange A,Mottram P,etal.CXCL12 and vascular endothe lial g row th fac tor synerg istically induce neoang iogenesis in hum an ovarian cancers[J].Cancer Res,2005,65:465-472.

[11]Hao L,Zhang C,Qiu Y,et al.Recom bination of CXCR4,VEGF, and MMP-9 p red icting lym ph nodem etastasis in human b reast cancer[J].Cancer Lett,2007,253(1):34-42.

[12]Brand S,Dambacher J,BeigelF,etal.CXCR4 and CXCL12 are inversely exp ressed in colorectal cancer cells and modulate cancer cellm igration,invasion and MMP-9 activation.Exp[J]. CellRes,2005,310:117-130.

[13]Samara G J,Law rence D M,ChiarelliC J,etal.CXCR4-mediated adhesion and MMP-9 secretion in head and neck squamous cellcarcinoma[J].Cancer Lett,2004,214:231-241.

[14]Sweeney P,Karashima T,Kim S J,et al.Anti-vascular endothelial grow th factor recep tor 2 antibody reduces tumorigenicity and metastasis in orthotop ic p rostate cancer xenografts via induction of endothelial cell apop tosis and reduction of endothelial cellmatrixm etallop roteinase type 9 p roduction[J].Clin Cancer Res,2002,8:2714-2724.

[15]李利义,徐斌,罗越,等.CXCR4和VEGF-C在胃癌淋巴结转移中的作用及相关性[J].浙江医学,2013,35(19):1722-1724.

Correlation of CXCR4,VEGF,MMP-9 expression w ith lymphatic metastasis in gastric cancer

LI Liyi,LUO Yue,LIU Haibin,et al.
Department of General Surgery,the Second Affiliated Hospital ofWenzhou Medical University,Whenzhou 325027,China

Objective To investigated the association of CXCR4,VEGF-C,MMP-9 exp ression with lymphatic metastasis in gastric cancer.Methods The exp ressions of CXCR4,VEGF-C and MMP-9 were detected by immuohistochem istry in 76 samp les of gastric cancer.The relationship between these markers and lymph node metastasis of gastric cancerwas analyzed.Results The exp ression of CXCR4、VEGF-C and MMP-9 was significantly associated with lymph node metastasis in gastric cancer(P＜0.01).The exp ressions of three p roteins were significantcorrelated w ith each other.Rate of lymph nodemetastasis in patients w ith exp ression of both CXCR4 and VEGF-C was 84.5%(28/33),which was significantly higher than that in patients w ith sing le p rotein exp ression(11/22,50.0%)or in those with negative exp ression(7/21,33.3%).Sim ilarly,the rate in patients w ith both VEGF-C and MMP-9 exp ression was 80.0%(32/40),which was higher than that in patients w ith sing le p rotein positive exp ression(9/19,47.4%),or in those w ith negative exp ression(5/17,29.4%).The rate in patients w ith both CXCR4 and MMP-9 exp ression was 83.3%(30/36),which was higher than that in patients w ith sing le p rotein positive exp ression(11/22,50.0%),or in those w ith negative exp ression(5/18,27.8%).The d ifferences were all found to be statistically significant(P＜0.01).The rate of lym ph nodemetastasis in patients w ith exp ression ofall three p roteins was 90.0%(27/30).Conclusion The exp ression of CXCR4, VEGF-C and MMP-9 is c losely correlated w ith lym ph nodemetastasis in gastric cancer,patients w ith positive exp ression of three markers aremost likely to have lym ph nodemetastasis.

CXCR4 VEGF-C MMP-9 Gastric cancer Lym phatic metastasis

2013-06-06）

（本文编辑：沈叔洪）

温州市科技计划基金（Y20090061）

325027温州医科大学附属第二医院胃肠外科