母乳对Caco-2 细胞缺氧复氧损伤模型NF-κB p65 表达的影响

陆 玲 王宇军 冯伟伟 毕明远 阮为勇

随着医疗水平的提高，早产儿和低出生体重儿存活率增加，新生儿坏死性小肠结肠炎( NEC) 的发生率呈上升趋势。近几年来，国内外专家对NEC 进行了深入的研究，但NEC 的病理机制尚未完全明确，缺乏有效的治疗药物，母乳喂养是目前唯一被证实有效的预防措施［1～3］。Meinzen 等［4］研究证实，母乳喂养降低了超低出生体重儿生后两周NEC 的发生率和病死率。尽管专家们已经证实了母乳对NEC 的防治作用，但尚未阐明相关的作用机制［5］。既往研究结果显示，NEC 发病与肠上皮细胞缺氧复氧损伤密切相关。因此，本实验旨在通过建立Caco -2 细胞缺氧复氧损伤模型，研究Caco-2 细胞NF-κB p65 表达及母乳对Caco-2 细胞缺氧、复氧损伤的防治作用，以探讨NEC的病理机制和母乳对NEC 的防治作用机制。

材料与方法

1.实验材料：(1) 细胞与主要试剂：Caco-2 细胞株( 中科院上海细胞库) ；母乳(2012 年6 月～2013 年6 月江苏省中西医结合医院产科正常分娩产妇) ； 人外周学红细胞裂解液( 中国深圳晶美生物工程有限公司) ； 核因子NF - κB p65 抗体( 美国CST 公司) ；反转录试剂盒( 美国MBI Fermentas 公司) ；PCR 引物( 中国上海生物工程技术服务有限公司) 。(2) 主要仪器设备：7500 荧光定量PCR 仪( 美国ABI 公司) ； CentroX3超灵敏微孔板发光检测仪( 德国Berthold 公司) ；311 / 3141 细胞培养箱( 美国Thermo Fisher 公司) ，d -63450 生物安全柜( 德国Heal Force 公司) ； ND -1000 核酸蛋白测定仪( 美国Nano Drop 公司) ；ELx 808 酶标仪( 美国Bio-Tek 公司) ；IX51倒置显微镜( 日本Olympus 公司) 。

2.实验方法： ( 1) Caco -2 细胞培养： Caco -2 细胞置于75cm2培养瓶中，采用DMEM 培养基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素- 链霉素双抗液，在37℃、5% CO2和90%相对湿度的环境中培养。每5 天按1∶3的比例传代，6 ～7 天基本达到融合。(2) Caco-2 细胞缺氧复氧损伤模型的建立［6］：传代后第6 天生长达到融合的Caco-2细胞，吸去90%的培养液，以减少气体弥散距离，剩余培养液能维持细胞存活。将其置入密闭容器中，负压抽吸其中空气，换入高纯氮气，密闭后置入培养箱中孵育90min( 缺氧) ，再取出，加培养液至原量，置入培养箱中孵育30min( 复氧) 。对照组细胞直接置培养箱中孵育。培养条件均为37℃、5% CO2和90%相对湿度。(3) 母乳上清液的提取：产妇生后2 ～4 天的母乳存于4℃冰箱，在24h 内处理，12000r/min 离心10min去除脂肪成分和细胞碎片，配制成5%的乳清用于实验；母乳煮沸5 分钟，12000r/min 离心10min 后配制成5%乳清，两组乳清均存于-20℃冰箱备用。(4) 实验分组：实验分为对照组和缺氧复氧损伤模型组，两组各有常规培养液组( MEM) 、未加热乳清组(5%BM) 和加热乳清组( 5%BMb) 。造模后向两组分别加入常规培养液、未加热乳清、加热乳清，继续培养6h后分别用RT-PCR 检测法和免疫荧光法检测各组细胞中NF-κB p65 表达情况。(5) RT -PCR 检测法： 根据试剂盒说明书操作，PCR 引物： GAPDH 引物上游引物：5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA - 3'，NF - κB p65 引物上游引物： 5' - AGGCTCCTGTGCGTGTCTCC-3'，下游引物：5' -GGGTGGGCTTGGGGGCAGGT-3'。(6) 免疫荧光法：对数期生长的细胞接种在24 孔培养板，每孔密度达到70% ～80%。用4%冰多聚甲醛固定细胞20min，PBS 洗15min，0.1% Triton X-100 室温10min。PBS洗后，用3%BSA 封闭1h，然后一抗4℃孵育过夜，随后用Texas Red 标记二抗室温孵育1h。DAPI 染色后封片，荧光显微镜下观察并拍照。

3.统计学方法：所有实验重复3 次，采用SPSS 16.0 软件进行分析，数据采用均数±标准差(±s) 表示，采用单因素方差分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.RT - PCR 检 测Caco -2 细 胞NF - κB p65 mRNA 的相 对 表 达： RT -PCR 检 测 结 果 显 示： 模 型MEM 组NF - κB p65 mRNA 的 相 对 表 达 明 显 高 于对照MEM 组，且差异有统计学意义( P ＜0.01) ，提示缺氧复氧处理后NF - κB p65 mRNA 高度表达；模型组内5%BM 组、5%BMb 组分别与MEM 组比较NF-κB p65 mRNA 表达量明显降低，对照组内5%BM 组、5%BMb 组分别与MEM 组比较NF -κB p65 mRNA 表达量明显降低，且差异均有统计学意义( P ＜0.01) ，提示对照组和模型组中，5%乳清和5%加热乳清均能下调NF -κB p65 mRNA 的表达，说明Caco -2 细胞缺氧复氧损伤前后5% 乳清和5%加热乳清都能下调NF -κB p65 mRNA 表达； 模型组内5%BM 组NF-κB p65 mRNA 的相对表达低于5%BMb 组，且差异有统计学意义( P ＜0.05) ，对照组内5%BM 组NF-κB p65 mRNA 的相对表达与5%BMb 组相比，，差异无统计学意义( P ＞0.05) ，提示Caco -2 细胞缺氧复氧损伤后5% 乳清下调NF-κB p65 mRNA 表达的作用较5%加热乳清更明显( 表1) 。

表1 Caco-2 细胞NF-κB p65 mRNA 的相对表达(±s)

表1 Caco-2 细胞NF-κB p65 mRNA 的相对表达(±s)

与对照MEM 组比较，* P ＜0.01；与模型MEM 组比较，#P ＜0.01；与模型5%BMb 组比较，▲P ＜0.05

组别 NF-κB p65 mRNA的相对表达MEM 1.00 ±0.10对照组 5%BM 0.48 ±0.05*5%BMb 0.45 ±0.08*MEM 2.12 ±0.22*模型组 5%BM 0.63 ±0.07#▲5%BMb 0.97 ±0.25#

2.免疫荧光法检测Caco-2 细胞中NF-κB p65表达：对照组Caco -2 细胞核内几乎无红色荧光，缺氧复氧模型组Caco-2 细胞核内均有红色荧光，MEM组最明显，5%BM 最少，说明缺氧复氧刺激后Caco -2 细胞质内的NF -κB p65 被激活进入细胞核表达，5%乳清可以抑制NF -κB p65 入核表达，并且较加热乳清作用更明显，这与RT - PCR 检测结果相符( 图1) 。

图1 免疫荧光法检测Caco-2 细胞中NF-κB p65 表达情况

讨 论

新生儿坏死性小肠结肠炎是NICU 中常见的消化道急症，目前缺乏有效的治疗药物，母乳喂养被众多专家证实为一种有效的防治手段［7，8］。新鲜母乳中含有多种免疫保护因子和生物活性物质，如免疫球蛋白、乳铁蛋白、表皮生长因子、转化生长因子、抗氧化酶、巨噬细胞、淋巴细胞、双歧因子等，能有效增加早产儿尚未发育成熟的胃肠道的免疫防御能力，促进肠道黏膜屏障的建立［8］。

NEC 主要表现为肠黏膜的损伤，既往研究显示，NEC 发病与肠上皮细胞缺氧复氧损伤密切相关。Caco-2 细胞源于人体结肠腺癌细胞，生长达到融合后有柱状凸起，向培养液一侧形成刷状缘，类似于小肠微绒毛，且含有与上皮细胞相关的酶系，其结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，能很好的模拟肠道吸收过程，目前已被广泛用于肠道相关疾病的体外研究以及药物吸收研究。本研究运用Caco -2 细胞缺氧复氧损伤模拟缺氧致NEC 病理过程，探讨母乳对NEC 的作用机制。

NF-κB 信号通路是炎症研究的热点，通常情况下NF-κB 以二聚体的形式存在，最普遍的二聚体是p65/p50，其与抑制性蛋白IκB 结合，以无活性的形式存在于细胞质中［9］。当受到某些因素刺激，IκB 磷酸化后迅速降解，NF-κB 二聚体得到释放，p65 激活后进入细胞核中，促进炎性因子的表达［10，11］。前期实验研究发现缺氧、复氧损伤后Caco-2 细胞中炎性因子IL-1β、IL -6、TNF -α 均明显表达，母乳能抑制这些炎性因子的表达，其可能是通过抑制NF - κB p65 的表达来实现。

本研究运用RT -PCR 和免疫荧光检测Caco -2细胞中NF -κB p65 的表达情况，RT -PCR 结果显示，Caco-2 细胞缺氧、复氧损伤前后5%乳清均能起下调NF -κB p65 mRNA 表达的作用，Caco -2 细胞缺氧复氧损伤后5%乳清下调NF-κB p65 mRNA 表达的作用较5%加热乳清更明显；免疫荧光法显示缺氧复氧刺激后Caco-2 细胞质内的NF-κB p65 被激活进入细胞核表达，5%乳清可以抑制NF - κB p65入核表达，并且较加热乳清作用更明显，这与RT -PCR 检测结果相符，进一步说明母乳能够抑制NF -κB p65 的表达，这可能是其防治NEC 的一个机制。欧洲儿科胃肠病、肝病和营养学协会( ESPGHAN) 颁布的文件指出，新鲜的生母母乳是早产儿的第一选择［12］。本实验用加热乳清做对照，证实新鲜母乳中的有效成分在加热后受影响或者部分受影响，因此新鲜母乳防治NEC 的作用更明显。

综上所述，本研究显示母乳可通过抑制NF -κB p65 的表达减轻缺氧复氧Caco -2 细胞的损伤，尤其是新鲜母乳作用更明显，为母乳防治NEC 提供一定的理论依据。因为母乳成分十分复杂，其对NEC 可能存在多重作用机制，需要进一步研究。

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9 翟慧，杨毅宁，马依彤，等. 氧化型低密度脂蛋白对NF -κB 信号通路的作用［J］. 细胞与分子免疫学杂志，2013，29( 12) ：1254 -1257

10 Tang T，Zhang J，Yin J，et al.Uncoupling of inflammation and insulin resistance by NF-kappaB in transgenic mice through elevated energy expenditure［J］.J Biol Chem，2010，285(7) ：4637 -4644

11 Gupta SC，Singh R，Pochampally R，et al. Acidosis promotes invasiveness of breast cancer cells through ROS-AKT-NF-κB pathway［J］.Oncotarget，2014，5(23) ：12070 -12082

12 ESPGHAN Committee on Nutrition，Arslanoglu S，Corpeleijn W，et al. Donor human milk for preterm infants： current evidence and research directions［J］. J Pediatr Gastroenterol Nutr，2013，57( 4) ：535 -542