KD 患儿血清对细胞活力及NF-κB 表达的影响和PDTC 的干预

薛超超 李 丰 仇慧仙 陈 其 张园海

川崎病( Kawasaki disease，KD) 是一种以全身中小血管炎为主要病变的儿童急性发热出疹性疾病，主要并发症是冠状动脉损害，可表现为冠脉扩张或者冠脉瘤［1］。近年来越来越引起儿科医师重视。遗憾的是至今未能建立公认稳定的KD 动物模型，研究多基于临床或体外细胞实验。虽然发病机制仍不完全清楚，但必然存在免疫系统的异常激活与炎性反应的过度扩大［2］。核因子-κB( NF -κB) 是一种具有基因转录功能的多项调控转录因子，在体内炎性反应过程中起到核心作用，能促发下游炎性连锁反应，所有炎症相关性疾病中几乎均能发现该通路的异常激活［3～6］。那么与冠脉病变密切相关的血管内皮细胞，其细胞内的NF -κB 信号通路能否在KD 患儿血清刺激下是否被过度激活，进而过度分泌各种细胞因子和炎性因子，造成细胞自身损害呢? 如果给予NF -κB 信号通路的抑制剂对该通路进行阻断，能否减轻血管内皮细胞的自身损害? 为证实这些猜想，笔者做了相关实验研究，现报道如下。

资料与方法

1.研究对象：2012 年7 月～2013 年6 月温州医科大学附属育英儿童医院儿童心血管科住院治疗的KD 急性期患儿30例，KD 诊断标准符合2004 年美国儿科学会和心脏病学会制定的KD 诊断标准［1］。病程均在1 周以内，未经过IVIG 治疗，排除其他免疫缺陷或者其他基础疾病。其中男性18 例，女性12 例，患儿年龄3 个月～4 岁，平均年龄2.3 ±1.4 岁。对照组为同期在笔者医院儿童保健科体检患儿30 例，其中，男性16 例，女性14 例，患儿年龄3 个月～4 岁，平均年龄2.56 ±2.22 岁，检查证实肝肾心功能正常，无基础心血管疾病，无感染性疾病依据。

2.标本采集： 抽取KD 患儿及对照儿童外周静脉血2ml，EDTA-K2 抗凝，1500r/min 离心5min，收集上清液，-80℃冰箱保存。

3. 细胞培养与分组： HUVEC 在RPMI1640 培养液( 含15%胎牛血清) 中培养24h，观察细胞已贴壁，生长良好，控制密度约1 ×106/培养瓶。随机分成4 组( 每组设10 个平行组) ：对照组( N 组) ，KD 血清组( K 组) ，IVIG 组( G 组) ，PDTC组( P 组) ，除去旧培养液，分别予不同的培养液继续培养( 表1) ，24h 后取出，用于下一步实验。

表1 各组培养液及干预情况(±s)

表1 各组培养液及干预情况(±s)

分组 培养液及药物干预对照组( N 组) RPMI1640 培养基+15%正常儿童血清KD 血清组( K 组) RPMI1640 培养基+15% KD 患儿血清IVIG 组( G 组) RPMI1640 培养基+15% KD 血清+IVIG(10g/L)PDTC 组( P 组) RPMI1640 培 养 基 + 15% KD 血 清 + PDTC(100μmol/L)

4.MTT 检测细胞活力： 取培养瓶中的HUVEC，调整细胞浓度为1 ×105/ml，接种于96 孔板，每孔加入100μl 细胞悬液，放入培养箱孵育24h，按实验的4 组给与不同的处理，每组设5 个平行孔，继续培养24h。然后每孔加5mg/ml MTT 20μl，继续培养4h，每孔加入二甲基亚砜( DMSO) 100μl，震荡10min，使晶体完全溶解，酶联免疫仪在波长490nm 处读取吸光度的A 值。

5.RT-PCR 检测NF - κB p65mRNA 的表达： 通过检索GenBank 数据库，利用Primer 5.0 软件设计引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列和预期PCR 产物长度见表2，用前稀释成10pmol/μl。按RNA 抽提试剂盒( Fermentas U.S.A) 说明书进行HUVEC 中RNA 的提取，RNA 的反转录，然后放入25μl 普通PCR 反应体系进行PCR 反应，反应条件见表3，扩增完成后取10μl PCR 扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳(120V，25 ～30min) ，紫外线灯下照相，用GelPro31 软件测电泳条带的IOD 比值。

表2 引物序列和预期PCR 产物长度

表3 目的基因的PCR 反应条件

6.Western blot 法检测HUVEC 胞核内NF -κB p65 蛋白的表达：按照碧云天核蛋白提取试剂盒说明书来提取HUVEC细胞核蛋白，BCA 法测蛋白浓度，制胶，各孔加入100μg 蛋白样品电泳，转膜，5%小牛血清封闭液封闭1h，加兔抗单克隆抗体NF-κB p65 65kDa 一抗(1∶500) 和兔抗单克隆抗体β-actin 45kDa(1∶1000) ，4℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次，加辣根过氧化物酶( HRP) 标记的羊抗兔二抗( 1∶5000) 室温孵育1h，TBST 洗膜3 次，膜与化学发光检测试剂反应5min，曝光。利用Quantity One 凝胶分析软件测定条带的IOD 比值。

7.统计学方法：采用SPSS 17.0 统计软件分析，全部数据进行正态性检验，计数资料均值用均值±标准差(±s) 表示，多组比较采用单因素方差分析( ANOVA) ，方差齐者两两之间比较采用SNK-q 检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.MTT 法检测各组HUVEC 的细胞活力： 各组HUVEC 细胞活力的A 值见表4，图1。结果显示： ①KD 血清刺激下，HUVEC 的细胞活力较对照组显著降低( P ＜0.05) ； ②在丙种球蛋白或PDTC 的干预下，HUVEC 的细胞活力较单纯KD 血清刺激组均有显著升高，且两种干预措施组间比较细胞活力差异无统计学意义。

表4 各组HUVEC 活力的A 值(±s)

表4 各组HUVEC 活力的A 值(±s)

与N 组相比，* P ＜0.05；与K 组相比，#P ＜0.05

组别 n A值10 0.612 ±0.036 K 组 10 0.325 ±0.054*G 组 10 0.576 ±0.047#P 组 10 0.516 ±0.032 N 组#

图1 各组HUVEC 细胞活力的A 值比较

2. RT - PCR 检 测 各 组HUVEC 中NF - κB p65mRNA 的 表 达： 各 组 HUVEC 的 NF - κB p65mRNA 电泳的灰度图( 图2) 及累计光密度相对值( IOD) ( 表5，图3) 。结果显示： ①KD 血清刺激下，NF- κB p65mRNA 表达较对照组显著增加( P ＜0.05) ；②在丙种球蛋白干预下，NF -κB p65mRNA表达较单纯KD 血清刺激组有下降趋势，但差异无统计学意义； ③在PDTC 的预下，KD 血清中NF - κB p65mRNA 表达较单纯KD 血清刺激组显著降低( P ＜0.05) ，且下降幅度较丙种球蛋白干预组显著( P ＜0.05) 。

图2 各组NF-κB p65 的电泳灰度

表5 各组NF-κB p65mRNA 的相对IOD 值(±s)

表5 各组NF-κB p65mRNA 的相对IOD 值(±s)

与N 组比较，△P ＜0.05； 与K 组比较，◇P ＜0.05； 与G 组比较，* P ＜0.05

组别 n NF-κ B p65 mRNA N 组10 0.599 ±0.033 K 组 10 1.219 ±0.024△G 组 10 0.879 ±0.012 P 组 10 0.459 ±0.060◇＊

图3 各组NF-κB p65mRNA 的相对IOD 值比较

3.Western blot 法检测各组NF -κB p65 蛋白的相对表达：各组HUVEC 胞核内的NF -κB p65 蛋白电泳灰度图( 图4) 及相对IOD 值表达( 表6，图5) 。结果显示：①KD 血清刺激下，NF -κB p65 蛋白的表达较对照组显著增加( P ＜0.05) ； ②在丙种球蛋白干预下，KD 血清中NF -κB p65 蛋白的表达较单纯KD 血清刺激组有降低趋势，但差异无统计学意义；③在PDTC 的预下，KD 血清中NF -κB p65 蛋白表达较单纯KD 血清刺激组显著降低( P ＜0.05) 。

图4 各组HUVEC 中NF-κB p65、β-actin 蛋白的灰度

表6 各组HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相对IOD 值(±s)

表6 各组HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相对IOD 值(±s)

与N 组比较，△P ＜0.05；与K 组比较，◇P ＜0.05

组别 n NF-κB p65蛋白N 组10 0.195 ±0.068 K 组 10 0.526 ±0.128△G 组 10 0.479 ±0.072△P 组 10 0.172 ±0.135◇

图5 各组HUVEC 中NF-κB p65 蛋白的相对IOD 值比较

讨 论

川崎病临床主要表现为发热( ＞5 天) 、不规则皮疹、颈部淋巴结非化脓性肿大、眼结合膜炎、口唇皲裂、杨梅舌、掌( 跖) 红斑、手足硬性水肿等，最严重的并发症是冠状动脉损害( CAL) ，表现为冠脉扩张或者冠脉瘤［1］，即使急性期未观察到CAL，成人期发生缺血性心脏病的危险性仍然增加［7］。KD 的发病机制尚不完全清楚，但必然存在免疫系统的异常激活与炎性反应的过度扩大。目前国际上较为认可的假说是，某种或某类病原体感染特殊基因的敏感个体，发生免疫系统的异常激活与过度扩大的炎性反应，进而出现的一系列病理过程［2］。所以寻找KD 的炎性反应核心环节，对KD 的发病机制和针对性治疗都有重要意义。

NF-κB 是一种多极基因调控的转录蛋白，具有广泛的生物学活性，在静息状态下，NF -κB 多以异二聚体的形式与IκB 结合存在于胞质，激活后进入细胞核发挥转录功能，进而直接或间接调控免疫炎性反应相关的靶基因如细胞因子、趋化因子、协同刺激分子及黏附分子表达，从而出现机体一系列的炎性反应表现，故认为NF-κB 信号通路在炎性反应中起到核心 作 用［8］。本 实 验 通 过 检 测 细 胞 内 NF - κB p65mRNA，细胞核内NF-κB p65mRNA 蛋白的表达，能够一定程度上反应细胞内NF -κB 信号通路的激活程度。有研究发现急性期KD 患儿外周血的单核-吞噬细胞中的NF -κB 信号通路处于异常激活状态，并且在发生冠脉损害( CAL) 的KD 患儿中更加显著，提示该信号通路在KD 的发生上可能起到关键作用［9］。但由于每个KD 患儿病程、病情轻重存在差异，患儿外周血单核-吞噬细胞数量少，故实验结果存在一定局限性。Saito 等［10］运用转基因技术，培育了E-DNIκB 模型小鼠，这种小鼠由于内皮细胞中IκBα 蛋白不能被降解，NF-κB 蛋白不能被释放进入细胞核发挥作用，结果发现E-DNIκB 模型小鼠在行腹主动脉切开再缝合术后，发生腹主动脉瘤的比例较正常小鼠明显减少，提示NF-κB 信号通路参与介导动脉壁细胞外基质的病理性重构，参与动脉瘤的形成，可能对KD 并发症起到关键作用。

血管内皮细胞是炎症早期效应靶向之一，能分泌多种炎性物质，目前国内外对血管内皮细胞的NF -κB 信号通路研究有限，故本实验选取的人脐静脉内皮细胞( HUVEC) 为研究细胞，实验中笔者发现在川崎病血清的刺激下，HUVEC 细胞活力显著下降，伴随细胞内NF-κB p65 mRNA 表达显著增强，细胞核内NF-κB 蛋白合成显著增加，提示KD 患儿血清中某些物质能促使细胞内的NF-κB 信号通路过度激活，并造成细胞自身的损伤。人体中冠状动脉内皮细胞位于血液与血管壁之间，如发生炎性介质过度分泌，不仅造成细胞自身损害，还能引起周围的血管基膜、内弹力膜破坏，最终导致冠脉扩张和冠脉瘤等并发症，故推测与KD 并发症关系密切［11］。

尽管KD 发病机制尚未明确，但标准疗法静脉注射用人免疫球蛋白( IVIG)2g/kg 联合阿司匹林口服方案的有效性已得到公认，使继发CAL 的发生率从自然病程的20% ～25%下降至3% ～5%［12］。IVIG 可从多方面对血管内皮细胞起到保护作用，如封闭血液中单核细胞、血管内皮细胞或血小板表面受体，通过调节炎性细胞功能，抑制炎性细胞黏附，中和病原体或毒素等［13～15］。本研究中在丙种球蛋白干预下，细胞活力较单纯KD 血清刺激组显著增强，伴随HUVEC 细胞内NF-κB p65 mRNA 表达和细胞核内NF-κB p65 蛋白表达较均有下降趋势，但差异无统计学意义，原因可能由于IVIG 的作用是多方面的，对该通路的抑制作用效果有限，或由于样本量较少导致的统计误差。但徐明国等［16］的实验结果显示IVIG 也能起到对NF-κB 信号通路显著抑制的作用，提示IVIG 抑制细胞NF -κB信号通路过度激活可能也是其药理机制之一。

那么单纯抑制细胞NF-κB 信号通路，是否可能对KD 的治疗有效呢? 吡咯烷二硫氨基甲酸酯( PDTC) 是一种强氧化剂，能通过抑制单核细胞-吞噬细胞浸润和抑制一氧化氮合酶( iNOS) 表达，直接或间接抑制反应性氧中间体( ROIs) 的产生等途径抑制IκB 蛋白降解，减少NF - κB 的核移位，起到对NF-κB 信号通路特异性抑制作用［17］。本实验中在PDTC 的干预下，HUVEC 细胞活力较单纯KD 血清刺激组显著增强，伴随细胞内NF -κB p65 mRNA 和细胞核内NF - κB p65 蛋白的表达均显著下降，提示PDTC 对在抑制NF -κB 信号通路的作用效果强于IVIG，并且对体外培养的内皮细胞也能起到和IVIG相近的保护作用。国外的研究还证实，PDTC 还能增强心肌梗死后心肌细胞对缺血再灌注损伤的耐受力，起到保护心肌细胞的作用。推测其有减轻冠脉扩张等并发症的作用，故说明PDTC 在KD 的治疗上有潜质的临床价值。但是在本实验中，笔者还发现由于PDTC 对NF-κB 信号通路强力的抑制作用，本实验中P 组NF-κB 蛋白表达水平甚至低于正常组。有实验研究证实，生物体内NF-κB 信号通路的作用广泛、调控精细，在炎性反应早期，可能起到保护作用，还对内皮细胞的其他正常生理功能也起重要作用，故只有能做到对NF-κB 信号通路的精确调控，特异性的抑制性药物才可能试用于临床［18］。

综上所述，本研究证明HUVEC 在KD 血清刺激下，细胞中NF-κB 信号通路被激活，造成细胞自身损害，推测与KD 的发生、发展密切相关。比较IVIG和PDTC 在体外HUVEC 的干预效果，证明PDTC 能通过抑制细胞核内NF - κB 蛋白的过度合成，增强HUVEC 对抗KD 血清的刺激，起到和IVIG 相近的保护作用，在KD 的治疗上有潜在的临床价值。同时应注意到人体内NF -κB 信号通路具有十分精细和复杂的调节机制，过度抑制很可能干扰正常生理功能，如何进行适度的抑制需要开展更深入的研究。

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