新型复方制剂斑晓胶囊对内皮祖细胞刺激活化的影响

王 贤 吴宗贵

在全世界范围内，随着人类生活水平的提高，社会老龄化的加剧，以动脉粥样硬化( atherosclerosis，AS) 为病理基础的心脑血管疾病逐渐成为危害人类健康的最主要的疾病。AS 及其并发症的研究在世界各国都作为心脑血管疾病研究中的重点。随着人们对AS 病因认识的日趋完善，血脂代谢异常、炎性反应、氧化反应等因素逐渐被发现。其中在血管缺血、损伤等病理过程中，内皮祖细胞( endothelial progenitor cells，EPCs) 的动员和补充起着非常重要的作用，并在缺血后血管组织重构过程中发挥着关键作用。EPCs 是一类具有较强增殖能力并能定向增殖为血管内皮细胞的前体细胞，具有增殖、黏附、迁移并形成血管结构的特定能力［1］。当前EPCs 在治疗方面的应用前景被广泛接受。EPCs 的体外分离培养来源很多，其中比较成熟的方法就是从骨髓中提取分离后刺激动员细胞增殖［2］。新型复方中药制剂斑晓胶囊，其中含有瓜蒌、薤白和三七。目前，临床和实验研究已经表明，斑晓胶囊可以显著降低血脂水平，抑制动脉粥样硬化的进展。本研究采用不同浓度斑晓胶囊萃取液作用于小鼠骨髓源性EPCs，观察其对细胞增殖及其功能的影响及探讨其可能的作用机制，以求为复方斑晓胶囊在AS 中的治疗提供实验依据。

材料与方法

1.实验动物：由第二军医大学基础部实验动物中心提供的6 ～8 周龄的C57BL/6 雄鼠，适应性喂养1 周。

2.主要试剂：EGM -2 培养基( Clonetics 公司) ；Flk1 -PE流式抗体( BD Pharmingen 公司) ； CD34 -FITC 流式抗体( BD Pharmingen 公司) ； Bcl -2 抗体( Santa Cruz 公司) Bax( Santa Cruz 公 司) ； CCK8 试 剂 盒( 翊 圣 生 物 公 司) ； Transwell 小 室( Falcon 公司) 。

3.药品：斑晓胶囊萃取液，由笔者医院药剂科提供。

4.小鼠骨髓EPCs 分离培养： 小鼠颈椎脱臼法处死，取下其股骨及胫骨，操作过程注意无菌，同时避免毛发沾染骨髓腔，小心剔除上面的肌肉组织，EGM2 培养基冲洗骨髓腔至骨髓腔发白。骨髓腔冲洗液用Ficoll 分离单核细胞，调整细胞密度为(2 ～3) ×106，平均接种到无菌6 孔板中，2 毫升/皿，置入37℃恒温CO2细胞培养箱中培养；培养第7 天可见大量单克隆细胞增殖，可进行流式鉴定CD -34 及VEGFR -2 双抗表型。

5.CCK8( cell counting kit8) 法检测细胞增殖情况：用上述提取分离EPCs 的方法将细胞悬液平均置于96 孔板中，培养48h 后换液，分别加药0、20、200μg/ml，分别在加药培养24、48、72h 后，向每孔加入10μl CCK8 溶剂，注意不要产生气泡，重新置于37℃，5%CO2孵育箱内4h，酶标仪检测490nm 处吸光度。

6.流式细胞术鉴定： 细胞培养4 天后分别用斑晓萃取液20μg/ml、200μg/ml 及空白对照分组刺激细胞，培养72h 后；吸净培养基，0.25%胰酶消化细胞，加入200μl 流式Buffer，加入上述双标抗体( 另空白对照组准备2 种抗体的单标标本已经空白标本，以作流式调补偿用) ，震荡后避光置于4℃冰箱孵育30min，取出离心1200r/min，去上清加流式Buffer，洗2遍，加300μl 的1%多聚甲醛固定，准备上机检测。

7.Transewell 法检测细胞迁移功能变化：用上述提取分离EPCs 的方法提取培养细胞，培养第7 天0.25%胰酶消化细胞，终止消化后离心去培养液，用PBS 洗2 遍，用无血清培养基M199 重悬，调整细胞密度至2 ×105；上室加入100μl 含细胞培养液，下室加入500μl 含药培养基0、20、200μg/ml； 孵育箱内培育24h；用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，结晶紫染色；镜下观察。

8.Western blot 法：检测EPCs 细胞Bcl-2/Bax 蛋白水平，上述方法提取EPCs 以5 ×105接种于6 孔板中，孵育箱内培养4 天后各组分别加入不同浓度斑晓液，分为3 组( 0、20、200μg/ml) 。第7 天加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液每孔60μl 于冰上(4℃) 静置15min 后12000g，4℃离心30min，采用BCA 法检测蛋白浓度后加入上样缓冲液，煮沸5 ～10min 变性，10%的分离胶进行SDS-PAGE 电泳，每孔上样总蛋白约30g 左右，后进行转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1h，TBS/T( 含0.2%Tween-20 的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水) 洗膜后加入Bcl-2、Bax 及β-actin 抗体，用5%二氨基联苯胺(3，3' -diaminobenzidine，BSA) 稀释(1∶1000 稀释) ，4℃摇床12h，TBS/T洗膜后二抗室温孵育1h，(1∶3000 稀释) ，ECL 化学发光剂倒在PVDF 膜5min 后进行显影。

9.统计学方法：采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，实验数据资料用均数±标准差(±s) 表示，CCK8，流式细胞鉴定，transwell 实验均采用t 检验进行数据分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.不同浓度的斑晓制剂可影响鼠源EPCs 的增殖：CCK8 实验结果表明，斑晓低剂量组(20μg/ml) 和高剂量组(200μg/ml) 与对照组相比细胞增殖能力明显增强［P ＞0.05( 第1 天、第2 天20μg/ml 斑晓组) ，P ＜0.05 ( 第3 天) ，图1］。

图1 不同浓度斑晓对EPCs 增殖的影响

2.流式细胞术鉴定CD34/Flk-1 双阳性细胞：实验结果表明，斑晓低剂量组(20μg/ml) (4.42% ±1.12%，P ＜0.05) 和高剂量组( 200μg/ml) ( 13.98%±0. 23%，P ＜0. 05) 药物作用72h 后与对照组(2.14% ±0.92%) 相比EPCs 明显增多( 图2) 。

图2 流式细胞术鉴定双阳性细胞的结果

3. Transwell 实验检测EPCs 迁移功能： 结果表明，斑晓低剂量组(20μg/ml) 和高剂量组(200μg/ml)药物作用24h 后与对照组相比结晶紫染色细胞明显增加( P ＜0.05，图3) 。

图3 不同浓度斑晓作用于EPCs 后细胞迁移功能明显变化

4.不同浓度的斑晓可增加EPCs Bcl -2/Bax 比值： Western blot 法实验结果表明，斑晓低剂量组(20μg/ml) 和高剂量组(200μg/ml) 药物作用72h 后与对照组相比EPCs 中Bcl -2 蛋白表达水平明显上升，Bax 蛋白水平下降，Bcl-2/Bax 比值升高( 图4) 。

图4 不同浓度斑晓作用于EPCs 48h 后Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平

讨 论

EPCs 可以存在于体内多种组织中，如骨髓、血液、脂肪组织、血管内膜等［3～5］。研究表明，内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成，但EPCs 主要起源于骨髓组织中，在其他组织中存在较少［6］。因此，相对来说，骨髓中的EPCs 含量丰富，取材方便，增殖能力更强，较适合作为EPCs 的取材来源。斑晓胶囊中各成分的配伍基础是汉代名医张仲景《金匮要略》中瓜蒌薤白白酒汤，近期研究表明其对心肌缺血疗效较好［7］。在此著名方剂的基础上结合现代医学动脉粥样硬化治疗新进展加入三七。制作工艺上沿袭既往中药制备的方法。

本研究通过CCK8 实验发现，同样在细胞培养第7 天，在药物作用72h 的情况下，斑晓低剂量和高剂量组与对照组相比可以明显促进EPCs 的增殖，差异有统计学意义( P ＜0.05) ，因此把72h 作为时间点进行Transwell 及Western blot 法检测。EPCs 的表面标记很多，有CD34、VEGFR -2( Flk -1) 、CD45、CD31等多种，鉴定方案多样，但多选取其中2 ～3 个表面标记作为鉴定依据［8，9］。其中CD34 是未成熟干细胞的表面标志之一，且EPCs 最早是通过CD34 抗体包被的免疫磁珠法从脐带血中分离获得，同时公认Flk-1是EPCs 的表面标志之一，故本实验选择CD34/Flk -1 双阳性标记作为流式细胞术鉴定EPCs 的方案［10］。流式鉴定的EPCs 数量与Jiang 等［11］实验结果相符，但目前尚缺少斑晓制剂对EPCs 的增殖效果的研究，本实验结果发现斑晓对小鼠骨髓源性EPCs 增殖具有促进作用，其结果与邝颖颐等［12］所做的三七总皂苷对EPCs 的影响结果相符。Transwell 小室实验通过多次重复实验取平均值的方法以降低人工误差，最终发现，斑晓高、低剂量组与对照组相比可增强EPCs的迁移功能，并呈现明显的剂量依赖性。本组研究还发现斑晓可提高Bcl-2/Bax 比值，并呈浓度依赖性。推测通过提高Bcl -2/Bax 比值抑制EPCs 凋亡是斑晓刺激EPCs 增殖活化可能的作用机制之一。

目前，斑晓胶囊可以显著降低血脂水平已在临床实验中得到证实，其提出的“痰瘀同治”的治法治则尚缺少有力的西医实验研究报道［13］。针对AS 软斑块，采用“痰瘀同治”治法治则可快速消退斑块和使斑块趋于稳定，其机制可能与改善EPCs 功能修复内皮有关。本研究结果提示，斑晓能够影响EPCs 的增殖和功能，对EPCs 凋亡过程的抑制作用是其可能的作用机制之一。本组实验从细胞学机制方面探讨了不同浓度斑晓对EPCs 增殖的影响，为今后的临床应用提供理论依据，其作用的靶点机制尚有待于进一步研究。

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