电穿孔法介导siRNA 高效转染小鼠原代软骨细胞

刘安军 麻献华 杨 瑞 高 琳 陈李斌佶 章卫平 谢志芳

RNA 干扰( RNA interference，RNAi) 是通过导入外源性小干扰RNA( small interference RNA，siRNA) ，使其通过碱基互补配对的原则与靶基因的mRNA 互补配对，继而引发靶mRNA 的降解、达到基因沉默的目的。由于RNAi 技术具有简单、快速和高效的优点，目前在基因的生物学功能研究中应用非常广泛［1］。RNAi 的效果与进入细胞内部的siRNA 的量具有直接相关性，因此建立高效率的siRNA 转染方法是保证基因沉默效果的先决条件［2］。

转录因子Sox9 高表达于软骨细胞，是调控软骨发育的关键分子之一［3］。为了进一步研究该分子在软骨细胞中的分子调控机制，需要建立有效的RNAi方法。然而原代软骨细胞被多种细胞外基质包围，应用一般的化学或物理转染方法很难达到理想的转染效率，而且原代软骨细胞在体外培养很容易去分化，不宜应用需要筛选的shRNA ( short hairpin RNA)［4］。目前文献中应用较多的是通过核电转法( nucleofector) 转染siRNA 达到基因沉默的目的，虽然该方法转染效率较高，但需要特殊的核电转仪以及软骨细胞专用的核电转液，价格比较昂贵［5］。本研究应用商品化的高效电转缓冲液和常规的电转仪，通过对原代软骨细胞进行电转前处理和采用优化的电转参数，建立了原代软骨细胞高效转染siRNA 的方法，达到满意的基因沉默效果和较高的细胞存活率。

材料与方法

1.原代小鼠软骨细胞的分离： 取出生后5 天的FVB 品系小鼠2 只，分离四肢关节及肋软骨，加入含0.1% Ⅰ型胶原酶( Worthington) 的DMEM 培养基，置于细胞培养箱中37℃消化1h［6］。然后在解剖镜下刷去软骨外的软组织，用磷酸盐缓冲液( PBS) 洗2 遍后，再用0.2% Ⅱ型胶原酶( 用含10%胎牛血清的DMEM 配置)37℃消化过夜。第2 天，加入1mg/ml 链丝菌蛋白酶( pronase，roche) 继续消化3h，期间每隔1h 吹打1次。

2.电穿孔转染质粒： 将上述获取的单个软骨细胞在室温下用PBS 洗两遍，计数。用电转缓冲液( BTX press high performance electroporation solution，harvard apparatus) 重悬细胞(5 ×105个细胞/100 微升) ，每100μl 电转缓冲液中加入5μg pCMV-EGFP-C1( clontech) 质粒，混匀后加入电转杯( 2mm gap) 中。电穿孔仪采用BTX ECM 830 机型( harvard apparatus) ，脉冲电压和时间为170V/15ms。电穿孔后立刻加入1ml已预温的高糖DMEM 培养基( 含有10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml 链霉素，2. 5μg/ml 两性霉素B，25μg/ml L-维生素C 磷酸酯) ，并转移至24 孔培养皿中，取少许细胞进行台盼蓝染色计数细胞活率，其余的细胞继续培养48h。

3.转染效率确定：电穿孔后48h，在荧光显微镜下随机取10 个视野，计数表达绿色荧光蛋白( 发绿光) 的细胞数，同时在可见光下计数细胞总数。计算转染率( %) =( 发出绿色荧光的细胞数/总细胞数) ×100%。

4.siRNA 转染及基因沉默效果的评估： 将用上述方法处理得到的原代软骨细胞，用电转缓冲液重悬细胞(5 ×105个细胞/100 微升) ，在每100μl 电转缓冲液中加入5μl 10μmol/L对照siRNA 或Sox9 siRNA( Santa Cruz 公司，sc -37007，SC -36534) ，混匀后加入电转杯(2mm gap) 中，选择170V/15ms 进行电转，电转后加入培养基培养48h。收获细胞用常规方法提取总RNA 和总蛋白，进行real-time PCR 以及Western blot 法检测分析Sox9 的mRNA 和蛋白表达量。实验重复3 次。

5.real-time PCR 分析：将总RNA 用DNAase 处理后反转录成cDNA，然后采用SYBR Green( Invitrogen) 反应体系进行real-time PCR 分析。Sox9 和内参36B4 的引物序列见表1。

表1 real-time PCR 所用引物的序列

6.Western blot 法分析：将得到的总蛋白定量后进行裂解变性，经10% SDS - PAGE 电泳分离后，转至硝酸纤维素膜上，以含5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭1h 后沿60kDa marker处裁开，分别加入一抗Sox9 抗体( Santa Cruz 公司，sc-20095)与β-actin 抗体( Proteintech 公司) ，4℃孵育过夜。TBST 洗膜3 次，每次5min，分别加入辣根过氧化物酶标记的二抗( 美国Vector 公司) ，室温孵育1h，TBST 洗膜3 次后，化学曝光显影。并用随机附带软件对目的条带进行灰度值扫描，计算出Sox9与内参β-actin 的灰度值比值，进行蛋白的半定量分析。

结 果

1.电穿孔后原代软骨细胞的存活率与质粒转染率分析：台盼蓝染色显示，采用170V 电压和15ms 的电转参数进行电穿孔pCMV -EGFP -C1 质粒后，原代软骨细胞的存活率为81.7% ± 3.6%。转染后48h，大部分细胞呈典型的软骨细胞形态( 卵圆形) ，其中部分细胞发绿色荧光，提示成功导入外源的绿色荧光蛋白( EGFP) 表达质粒( 图1) 。EGFP 阳性细胞数为37.3% ±5.2%。

图1 原代软骨细胞电穿孔转染pCMV-EGFP-C1质粒48h 后表达绿色荧光蛋白(EGFP)

2.siRNA 转染后的细胞存活率与RNAi 效果分析：电转对照和Sox9 siRNA 后，原代软骨细胞的存活率分别为83.7% ±5.2%和85.0% ±3.5%。实时PCR 和Western blot 法检测分析结果表明，原代软骨细胞转染Sox9 siRNA 48h 后，Sox9 mRNA 和蛋白的相对表达量与转染对照siRNA 组相比分别下调了75% ±4%和66% ±10%，达到了理想的基因沉默效果( 图2) 。

讨 论

本研究应用商品化的高效电转缓冲液和普通电转仪，建立了原代软骨细胞高效转染siRNA 的方法，达到了理想的基因沉默效果和较高的细胞存活率。实验成功的关键主要与以下几个因素相关。

图2 原代软骨细胞转染Sox9 siRNA 48h 后Sox9 mRNA 和蛋白表达下调

首先，电穿孔前原代软骨细胞的充分消化至关重要。软骨细胞能分泌多种细胞外基质，这些细胞外基质在软骨细胞周围形成较致密的结构［7］。常规的Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶处理能够得到游离的单个软骨细胞，但并不能彻底地将包裹在细胞膜外的基质成分消化掉，这样就会大大影响电穿孔的效率。笔者在预实验中发现将用Ⅰ型和Ⅱ型胶原酶消化的软骨细胞直接进行电穿孔，同样的电穿孔条件会导致大量细胞死亡。因此笔者用1mg/ml 链丝菌蛋白酶( pronase) 对这些已经游离的软骨细胞进一步消化，并通过间断吹打促使其细胞外基质的酶解。链丝菌蛋白酶是从链球菌( streptomyces griseus) 中分离到的含有多种肽链内切酶( 丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶) 和外肽酶的混合物，因此能将很多种蛋白水解成单个氨基酸( https： //lifescience.roche.com/) 。将该酶的浓度和消化时间控制在适当范围内，可以用于消化细胞外基质。事实上该酶也被应用于人软骨细胞的核电转前处理［5］。

其次，笔者选用了商品化的高效电转缓冲液，虽然不知道该缓冲液的具体成分，但该种缓冲液能提高一些普遍被认为难以电转的细胞的存活率与转染效率( http： //www. btxonline. com/) 。笔者的实验表明该缓冲液适用于原代软骨细胞。虽然在目前的参数条件下，质粒的转染率只有37.3% ±5.2%，但siRNA只有20 对左右核苷酸，比质粒小得多［8］。因此应用目前的电穿孔参数既能保证较高的细胞存活率又能达到满意的RNAi 效果。

当然，笔者实验的成功还与选择高效的Sox9 siRNA 有关。该产品含有3 种不同的针对靶分子的siRNAs，保证了基因沉默的效果。

1 Fellmann C S W . Lowe. Stable RNA interference rules for silencing［J］. Nat Cell Biol，2014，16(1) ：10 -18

2 Nayak TR，Krasteva LK，Cai W. Multimodality imaging of RNA interference［J］. Curr Med Chem，2013，20(29) ：3664 -3675

3 Dy P，Wang W，Bhattaram P，et al. Sox9 directs hypertrophic maturation and blocks osteoblast differentiation of growth plate chondrocytes［J］. Dev Cell，2012，22(3) ：597 -609

4 Gosset M，Berenbaum T，Thirion S，et al. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes［J］. Nat Protoc，2008，3(8) ：1253-1260

5 Haag J，Voigt R，Soeder S，et al. Efficient non-viral transfection of primary human adult chondrocytes in a high-throughput format［J］. Osteoarthritis Cartilage，2009，17(6) ：813 -817

6 Mirando AJ，Dong Y，Kim J，et al. Isolation and culture of murine primary chondrocytes［J］.MethodsMol Biol，2014，1130：267 -277

7 Wilusz RE，J Sanchez-Adams，F Guilak. The structure and function of the pericellular matrix of articular cartilage［J］. Matrix Biol，2014，39C：25 -32

8 Juffermans LJ，Meijering DB，van Wamel A，et al. Ultrasound and microbubble-targeted delivery of small interfering RNA into primary endothelial cells is more effective than delivery of plasmid DNA［J］. Ultrasound Med Biol，2013，40(3) ：532 -540