稀土在球兰组织培养技术中的促根研究

唐 敏

成都农业科技职业学院

球兰（拉丁学名：Hoya carnosa（L.f.R.Br），又名：马骝解、狗舌藤、铁脚板等，属捩花目萝藦科球兰属植物。 攀援灌木，附生于树上或石上，茎节上生气根。 分布于云南、广西、广东、台湾；热带及亚热带其他地区也有栽培或野生。球兰开花时绽放一簇簇伞形的腋生聚伞花序,常常由12～30 朵星状小花聚集成球形,故名球兰［1］随着植物组织培养技术的发展，球兰通过组培技术进行商业化批量培育生产已是趋势。传统的球兰的培育几乎都是通过扦插繁殖法， 但此繁殖法生根慢，成活移植后，发苗势不旺，生长也比较缓慢。因此，通过组织培养技术来繁殖球兰，是解决以上繁殖问题的重要技术手段。 目前，球兰的组织培养技术在实验室阶段性实验已有报道，有了建立起无菌系并能扩繁的先例， 然而此技术日前还只停留在实验室可行阶段，只是提供了应用组织培养技术的手段，而非是良好运用组织培养技术的方法。 随着市场的需要，组织培养技术应用在球兰的培育上，主要是期望能进行批量生产并提高瓶苗的移栽成活率，这也是目前亟待解决的重点问题。 而要提高瓶苗的质量和移栽成活率，在球兰组织培养的过程中，组织培养的生根培养基配方是关键。本实验在球兰的生根基础培养基配方中添加了稀土元素，在实验结果中得到了明显的效果。

一、材料与方法

1.外植体选取

从市场上买入较好的球兰品种， 选择长势较好，无病虫害的若干成熟叶片作为外植体。 氯化镧Lacl3和硝酸镧La(NO3)3为国产分析纯。

2.外植体消毒灭菌

将外植体的叶片用洗衣粉溶液洗涤，然后用清水冲洗20 分钟；在超净工作台上，用体积分数为75%乙醇溶液浸泡15 秒，无菌水冲洗2 次，再置于0.1%升汞溶液中浸泡10 分钟，最后用无菌水冲洗4～5 次，滤干水分；用解剖刀将经表面灭菌的叶片切成0.5 平方厘米的小块，待接种。

3.培养基制备

（1）基本培养基的制备。 根据MS 和White 母液成分及用量称取药品，使其充分溶解，并按相应浓度分别依次取用，先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、铁盐母液和有机成分。

（2）按外植体诱导培养基、增殖继代培养基、芽分化培养基及生根培养基来加入激素， 其分别添加为：外植体诱导培养基： MS+KT 0.5 毫克·升-1+6-BA 0.5 毫克·升-1+NAA 0.5 毫克·升-1；增殖继代培养基：MS+6-BA 1.5 毫克·升-1+NAA 0.2 毫克·升-1；芽分化培养基： MS+ KT 0.5 毫克·升-1+ NAA 0.5 毫克·升-1+ GA 1.0 毫克·升-1； 生根培养基：White+GA 0.5毫克·升-1+Lacl3或者是La(NO3)3，其分别设置添加有8 个不同浓度氯化镧和硝酸镧， 即： 氯化镧（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、5、10 毫克·升-1）+硝酸镧（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、5、10 毫克·升-1）。

（3）溶化琼脂。称取琼脂7 克·升-1，用蒸馏水加热烧开熔化琼脂，待琼脂完全熔化后，把调配好的激素和稀土元素溶液加入，用pH 试纸测pH 值，并用0.1摩尔·升-1的NaOH 或Hcl 调节pH 值为5.8， 最后加水定容至所需体积。

（4）分装。将配好的培养基分装于培养瓶中，分装时注意不要把培养基倒在瓶口上， 以防引起污染，然后用封口膜或瓶盖封口，装入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。

4.组织培养

将外植体在超净工作台上接种于外植体诱导培养基上，培养30 天后，将形成的愈伤组织用解剖刀进行分切， 分别转接于增殖继代培养基上进行培养；愈伤组织进行增殖继代培养后，再将其转接于芽分化培养基上进行丛生芽和芽点的促生培养； 当芽生长至2～3 厘米高的壮苗时，从瓶中取出，转入生根培养基中进行生根培养。 以0 毫克·升-1作对照，生根苗每处理10 瓶，每瓶接种5 株无菌幼苗，于光照强度1500～2000 勒克斯，光照时间12 小时·天-1，温度（25±2）℃的条件下培养，60 天后观察实验结果并对数据进行统计分析。

5.移栽

将生根后的球兰组培苗进行炼苗后移栽。

6.数据测定与方法

接种60 天后统计球兰生根数、生根率（生根率=生根的丛生数／接种的丛生数×100%）、根长（游标卡尺测定） 以及存活率 （存活丛生数／接种丛生数×100%）。 每个指标重复3 次测定。

7.试验数据采用spass16.0 软件进行单因素方差分析。

二、结果分析

1.氯化镧对球兰组培苗的生根及抗性影响

表1 氯化镧对球兰组培苗生根率及移栽成活率影响

从表1 看出，当Lacl3的浓度为0.2 毫克·升-1时，球兰的根长、生根数、生根率及存活率都是最佳，分别数值为：2.86、2.83、100 及100。由此得出，适当的添加Lacl3，对球兰的生长是有利的，但当超过一定量值时，随着浓度的增加，其效果越不理想。 Lacl3添加的最佳浓度为0.2 毫克·升-1.。

2.硝酸镧对球兰组培苗的生根及抗性影响

表2 硝酸镧对对球兰组培苗生根率及移栽成活率影响

从表2 得出结论， 当La (NO3)3的浓度为0.6 毫克·升-1时，球兰的根长生长指数最佳，为3.53，而当La(NO3)3的浓度为0.4 毫克·升-1时，生根数为最佳值3.66。当La(NO3)3的浓度为0.2～0.6 毫克·升-1时，生根率及存活率都是最佳，数值均为100。由此得出，当La(NO3)3的浓度为0.2～0.6 毫克·升-时，对球兰的生长是有利的，但当超过0.6 毫克·升-时，随着浓度的增加，其效果越不理想。La(NO3)3添加的最佳浓度为0.4～0.6毫克·升-1。 在促进球兰的根长生长时，La(NO3)3的浓度以0.6 毫克·升-为最佳， 而较低的浓度则有利于根系的数量增长， 当La (NO3)3的浓度为0.4 毫克·升-1时，其生根数较多。

三、讨论

大量研究表明，稀土元素具有一定的生理调控特性，对植物生长发育和品质改善具有促进作用，但根据相关文献资料看出，不同材料所用稀土种类、浓度和不尽相同，因此确定特定植物、组织、器官的最佳稀土种类、浓度需要不断摸索［2,3］。

从以上表中看出， 稀土浓度较低浓度时， 即在0.2～0.6 毫克·升-1时对球兰根系的生长有一定促进作用，但随着浓度的不断升高，反而起到了抑制作用，与段晓宇等［4］在稀土对细茎石斛组培苗影响的研究结果有一致性。 据文献，稀土元素具有一定的生理活性，影响植物的外部形态和生长发育，对植物有较好的抗逆效应［5］，可促进植物根系生长发育，影响酶活性［6］。在本实验中，稀土对根的促进作用很明显。在表1 中，稀土Lacl3对球兰的促根作用峰值为浓度达0.2 毫克·升-1，其根长和数量都达最佳。 在表2 中，稀土La(NO3)3对球兰的促根作用峰值为浓度达0.6 毫克·升-1时，其根长是最佳值，在一定范围内，较高浓度有利于根的伸长生长；促根数量最佳浓度峰值为0.4 毫克·升-1。周青等［7］在对La 在大豆幼苗作用的研究中得出，其机制在于La 能促进植物光合作用,增加叶绿素含量,提高硝酸还原酶和脱氢酶活性,促进根系生长。

本实验研究发现，氯化镧和硝酸镧对球兰根系的作用在浓度上有所区别。 氯化镧在浓度为0.2 毫克·升-1时， 球兰的根在长度和数量上都达到了显著；而硝酸镧的浓度则相对高一些， 在达到0.4～0.6 毫克·升-1时，其促根作用才得到显著表现。

本研究中，稀土对球兰组培苗的生根率和存活率（抗逆性）有一定影响，在一定浓度范围内有所良好表现，但差异不显著，但是超出了一定浓度，氯化镧在超过0.6 毫克·升-1和硝酸镧超过0.8 毫克·升-1时，表现出抑制作用。 据文献报道，使用稀土,可增强作物对不良环境条件的抵抗能力， 但高浓度稀土则效果不明显,甚至产生药害。 对于稀土元素能增强作物的抗逆性， 宁加贲认为在于稀土离子能与细胞膜的磷脂结合,调节钙的代谢,并取代Ca2+离子,参与与Ca2+有关的许多生理过程。 所以,稀土离子能维持细胞膜的通透性和稳定性,提高细胞膜的保护功能,增强作物对不良环境的抵抗能力。

［1］高尚士.藤本奇花-球兰[J].国土绿化,2005,3:43.

［2］汪燕鸣，王飞，王跃.稀土元素农业应用的研究进展［J］.化工时刊，2007，21（2）：47-49.

［3］李永裕，潘腾飞，邱栋梁.稀土元素对植物生物学作用机制的研究进展 ［J］. 中国农学通报，2005，21（12）：217-221.

[4]段晓宇，汪维双，杨红等.硝酸镧、硝酸铈对细茎石斛组培苗生长的影响[J].四川农业大学学报，2012，30（2）：2-3.

［5］阮志平，王芬芬，黄全能等.硝酸镧处理对短穗鱼尾葵幼苗耐寒性的影响 ［J］. 热带作物学报，2011，32（6）：1055-1059.

［6］郝红建，常江，张自立等.稀土在植物抗逆中的生理作用[J］.中国稀土学报，2003，21（5）：487-490.

[7]周 青,黄晓华,曹玉华等. La 对Pb,Cd 复合污染大豆幼苗的缓解作用[J].中国稀土学报,1998,16(4):366.