参苓白术散通过ERK/p38 MAPK 信号通路干预溃疡性结肠炎大鼠结肠组织AQP3、AQP4 的表达

李姿慧， 王 键* ， 蔡荣林， 刘晓丽， 蒋怀周

(1. 安徽中医药大学中医临床学院，安徽 合肥230038;2. 安徽中医药大学针灸经络研究所，安徽 合肥230038)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病，中医学认为其属于“泄泻”、“赤沃”、 “大瘕泄”等范畴，脾虚湿困是其主要病机［1-2］。近年来研究发现，参苓白术散治疗溃疡性结肠炎在临床上应用广泛，且疗效显著［3-4］，但是有关其作用机制和途径的研究却鲜见报道。前期研究中发现参苓白术散能显著增强脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织中水通道蛋白(aquaporin，AQP)4 蛋白及mRNA 的表达［5］，参苓白术散对AQP 表达的调节作用可能是其发挥治疗效应的主要作用机制之一。为进一步探明参苓白术散治疗UC 的作用机制，本研究通过细胞外信号调节激酶(ERK1/2)特异性抑制剂1，4-二氨基-2，3-二氰基-1，4-双(邻氨基苯巯基)丁二烯［1，4-Diamino-2，3-dicyano-1，4-bis (o-aminophenylmercapto)butadiene，U0126］ 和p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)特异性抑制剂4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑［4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole，SB203580］ 的干预，观察不同抑制剂对参苓白术散治疗脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠AQP 调节变化的作用，探讨ERK/p38 MAPK 信号通路在参苓白术散调控脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织AQP3、AQP4 表达中的作用，为临床应用参苓白术散治疗UC 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar 大鼠，SPF 级，4 ～6周龄，雌雄各半，60 只，体质量 (200 ± 20)g(南京医科大学实验动物中心，批号SCXK ［苏］20100004)。

1.2 试剂与药品U0126 (MEK1/2 抑制剂)、SB203580 (p38MAPK 抑制剂) (碧云天生物技术研究所)。参苓白术散方选人参15 g、茯苓15 g、白术15 g、陈皮9 g、莲子肉9 g、白扁豆(姜汁浸，去皮)12 g、薏苡仁9 g、缩砂仁6 g、山药15 g、桔梗6 g、甘草(炒)9 g (安徽中医药大学中药制剂室)。丙烯酰胺(美国Sigma 公司);BCA蛋白质定量试剂盒(碧云天生物技术研究所);逆转录试剂盒(RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas 公司，货号00064525);Tris 碱(美国sigma 公司);荧光定量试剂(日本TaKaRa公司);PVDF 膜(美国millipore 公司);甲醇(上海中试化工总公司);Trizol Reagent (美国invitrogen 公司，货号15596-026);电化学发光(ECL)试剂盒(美国Pierce 公司);高灵敏度化学发光检测试剂盒(美国Pierce 公司);甲叉双丙烯酰胺(美国AMRESCO 公司);PCR 试剂(美国Fermentas 公司);DEPC (德国Ruibio 公司);引物及探针合成(美国Invitrogen 公司)。

1.3 动物模型制备与给药方法 实验动物按照随机数字法分为正常组、模型组、参苓白术散组(简称治疗组)、SB203580 + 参苓白术散组和U0126 +参苓白术散组，每组12 只。脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠模型采用TNBS/乙醇灌肠结合环境与饮食干预法复制［6］，造模成功后，参苓白术散组、U0126 +参苓白术散组和SB203580 +参苓白术散组灌胃予参苓白术散煎剂12 g/(kg·d)(按照《药理实验方法学》“不同动物等效剂量折算系数表”折算)，正常对照组和模型对照组灌胃予0.9%氯化钠注射液l0 mL/(kg·d)，连续14 d。U0126 +参苓白术散组和SB203580 +参苓白术散组分别在灌胃前30 min 经尾静脉注射阻断剂U0126［溶解于二甲基亚砜(DMSO)，按0.1 mg/kg 体质量计算用量］和SB203580 (溶解于DMSO，按1.5 mg/kg 体质量计算用量)，正常对照组和模型对照组经尾静脉注射含相同DMSO 量的PBS 溶液作为对照。

1.4 蛋白质印迹法检测结肠组织AQP3、AQP4 蛋白表达 实验结束后麻醉大鼠(10%水合氯醛，3 mL/kg)，开腹截取距大鼠肛门约8 cm 处的结肠组织，生理盐水冲洗后放入液氮中备测。每组各取6只大鼠结肠组织按照Western blot 法操作规程测定结肠组织AQP3、AQP4 蛋白表达。

1.5 荧光定量PCR 法检测结肠组织AQP3、AQP4 mRNA 表达 取每组其余6 只大鼠结肠组织，经RNA 的提取、逆转录反应后，在95 ℃10 min，95℃15 s，60 ℃1 min，40 cycles 反应条件下进行荧光定量PCR 反应。AQP3:探针5'-CCTCCATGGGCTTC-3'，正向引物5'-GCCTTGTGGTCCTGGTCATT-3'，反向引物5'-GGTTGA CGGCATAGCCAGAAT-3'。βactin:探针5'-CGGCTA CAGCTTCACCACCACGGC-3'，正向引物5'-GAC TACCTCATG AAGATCCTCACC-3'，反 向 引 物 5'-TCTCCTTAA TGTCAC GCACGATT-3'。AQP4:探 针 5'-CCCTGCAGTTATCATG-3'，正向引物5'-TGAATCCAG CTCGATCCTTTG-3'，反向引物5'-TAT CCAGTG GTTTTCCCAGTTTC-3'。采用relative quantification study 法，以2-ΔΔCt为分析指标进行结果分析。

2 结果

2.1 各组大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白表达比较 与正常组比较，模型组大鼠AQP3、AQP4 蛋白表达均显著下降，组间差异有统计学意义(P ＜0.05)。与模型组相比，参苓白术散组大鼠AQP3、AQP4 蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(P ＜0.05);SB203580 +参苓白术散组与U0126 +参苓白术散组大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白表达较模型组升高，但与参苓白术散组比较差异均有统计学意义(P ＜0.05)。提示参苓白术散治疗可明显上调脾虚湿困型UC 大鼠AQP3、AQP4 蛋白的表达水平，通过阻断ERK/p38 MAPK 信号通路可以在一定程度上降低参苓白术散的调节作用。具体结果见图1、图2。

图1 不同处理因素对大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白表达的影响Fig.1 Effects of different agents on the expressions of AQP3 and AQP4 protein

图2 不同处理因素对大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白表达的影响(±s，n=6)Fig.2 Effects of different agents on the expressions of AQP3 and AQP4 protein (±s，n=6)

2.2 各组大鼠结肠组织AQP3、AQP4 mRNA 表达比较 荧光定量PCR 检测结果显示，模型组大鼠结肠组织AQP3、AQP4 mRNA 表达水平与正常组相比明显降低，组间有显著性差异(P ＜0.05)，提示AQP3、AQP4 mRNA 在脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织中的表达明显下降。参苓白术散组大鼠结肠组织AQP3、AQP4 mRNA 表达量与模型组相比明显升高(P ＜0.05)，表明参苓白术散治疗可以显著提高脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织AQP3、AQP4 mRNA 的表达水平。SB203580 +治疗组与U0126 +治疗组大鼠结肠组织AQP3、AQP4 mRNA 表达较模型组有较小幅度升高，但是仍明显低于参苓白术散组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见图3、图4。

图3 不同处理因素对大鼠结肠组织AQP3 mRNA 表达的影响(±s，n=6)Fig.3 Effects of different agents on the expression of AQP3 mRNA (±s，n=6)

图4 不同处理因素对大鼠结肠组织AQP4 mRNA 表达的影响(±s，n=6)Fig.4 Effects of different agents on the expression of AQP4 mRNA (±s，n=6)

3 讨论

现代医学认为，AQP 广泛存在于人体肺、胃、肠等器官内，AQP 对不同种类细胞膜的跨膜水转运发挥着重要的介导作用［7-8］，能显著增加细胞膜的透水性，对保持生命体内稳态水平衡具有关键的作用［9］。近年来研究表明，AQP 与中医理论的肺、脾、肾等功能密切相关。研究发现，脾胃湿热证的发生与AQP3、AQP4 的表达水平有一定的关系［10-11］，且慢性浅表性胃炎脾胃湿热型患者中湿重于热者的AQP3 表达多为阳性，提示AQP3 的异常表达可能参与了脾胃湿热证的发生机制［12］。周正等［13］的研究同时证实，脾胃湿热证的发生与AQP4 的异常表达亦密切相关。王晓玲［14］的研究发现腹泻状态下，大鼠结肠组织AQP4 的表达呈异常低表达状态，可能是AQP 的异常表达导致结肠对肠腔内的水分吸收减少，从而引起大便溏薄［15］。另外，在前期研究发现脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织的SOD 活性显著下降，MDA 水平明显升高［16］，血清IFN-γ 水平升高，血清IL-4 水平降低［17］，结肠组织AQP4 蛋白及mRNA 表达量减少［5］。本实验结果显示，脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 均呈异常低表达，提示脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织AQP3、AQP4 表达显著降低，水通道蛋白的表达异常可能是湿病的重要机制之一。参苓白术散治疗后大鼠AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 水平较脾虚湿困型UC 大鼠显著升高，表明参苓白术散治疗能够调节机体水通道蛋白表达水平，参苓白术散对UC 的治疗作用与其对AQP 表达水平的调节有关。

ERK1/2、p38MAPK 是MAPK 信号通路的重要成员，分别具有调控细胞的生长与分化和调节炎症与细胞凋亡等应激反应的作用。前期研究［18］发现ERK、p38MAPK 蛋白在脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织中的表达明显增强，参苓白术散能显著降低结肠组织ERK、p38MAPK 的表达水平。有研究表明AQP 的表达与MAPK 信号通路的激活密切相关［19-20］。师 忠 芳 等［21］发 现，应 用U0126 阻 断MAPK 信号通路，抑制ERK1/2 的磷酸化和激活，对损伤刺激所引起的星形胶质细胞AQP4 mRNA 表达的下调有拮抗作用，研究认为MAPK 信号通路对星形胶质细胞AQP4 mRNA 表达的调节有重要作用［22］。SB203580 是p38MAPK 信号通路特异性抑制剂，能通过抑制MAPK 酶活性，抑制后续MAPKAPK-2 和MAPKAPK-3 的激活，从而调控炎症介质和细胞因子产生［23］。王耀辉等［24-25］研究发现，p38MAPK 参与了大鼠脑缺血再灌注后AQP4 表达上调及脑水肿形成，P38 抑制剂SB203580 可减轻大鼠脑缺血再灌注后AQP4 表达及脑水肿，其机制可能与SB203580 抑制p38MAPK 的激活降低了下游AQP4 的表达有关。马小燕等［26］发现复方丹参注射液可通过激活MAPK/ERK1/2 信号通路上调人羊膜上皮细胞中AQP3 的表达水平，U0126 可通过抑制MAPK 信号通路下调AQP3 的表达。本实验结果发现，SB203580 +治疗组与U0126 +治疗组大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表达较模型组有较小幅度升高，但与正常组及参苓白术散组相比均有显著性差异(P ＜0.05)。提示参苓白术散可显著改善大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表达，ERK/p38 MAPK 信号通路参与了参苓白术散对脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织AQP3、AQP4 表达的调节作用。

综上可见，脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 呈异常低表达，参苓白术散能够显著提高脾虚湿困型UC 大鼠结肠组织AQP3、AQP4 蛋白及mRNA 表达水平，通过阻断ERK/p38 MAPK 信号通路可以在一定程度上降低参苓白术散的调节作用。因此，本研究结果认为参苓白术散治疗脾虚湿困型UC 的可能机制是通过抑制结肠组织ERK/p38 MAPK 信号通路的激活，从而调控AQP 的表达水平，促进脾主运化水液功能的恢复和改善机体水液代谢功能的作用。但是由于引起AQP 表达变化的原因众多，其他信号通路亦可能参与了参苓白术散对AQP 的调节，各种生理病理状况下、AQP 表达调控的机制仍有待进一步阐明。参苓白术散治疗脾虚湿困型UC 的调控机制及对MAPK信号通路的作用靶点尚需进一步深入研究。

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