赤芍、当归和漏芦对醋延胡索中延胡索乙素的影响

郭志烨， 韩 丽*， 杨 明，2， 刘李梅， 何 婧， 邹文铨

（1、成都中医药大学 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都611137；2.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌330004；3.四川大学，四川成都610064）

赤芍、当归和漏芦对醋延胡索中延胡索乙素的影响

郭志烨1， 韩 丽1*， 杨 明1，2， 刘李梅1， 何 婧1， 邹文铨3

（1、成都中医药大学 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都611137；2.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌330004；3.四川大学，四川成都610064）

目的考察醋延胡索与赤芍、当归、漏芦合提对延胡索乙素含有量的影响。方法制备醋延胡索与赤芍、当归、漏芦合提水提液，采用高效液相色谱 （HPLC）法测定各提取液或者浓缩液中延胡索乙素质量浓度并计算提取率或转移率，采用pH计测量各提取液pH值。结果醋延胡索与赤芍、当归合提均会降低延胡索乙素提取率，其中赤芍影响较大；配伍导致的pH值的改变对提取率无影响；常压浓缩和减压浓缩过程会损失少量延胡索乙素。结论碱性的延胡索乙素与合提药物中酸性的鞣质反应生成沉淀是合提液中延胡索乙素质量浓度较低的主要原因。

醋延胡索；延胡索乙素；合提；赤芍；当归；漏芦；沉淀反应

延胡索为罂粟科Papaveraceae紫堇属植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎，据古医药书籍记载有活血散瘀、理气止痛的功效。现代科学研究［1］表明延胡索具有很好的镇痛、镇静和催眠的药理作用，其药效成分为生物碱类，其中尤以延胡索乙素作用最强。有研究表明［2］游离生物碱难溶于水，经醋炙后，其生物碱与醋酸结合成易溶于水的醋酸盐，煎煮时易于溶出，从而更好地发挥药效，所以临床延胡索常以醋炮制品水煎煮入药。前期实验研究发现以醋延胡索计生药浓度相同的醋延胡索单独提取的提取液和醋延胡索与其他药物 （赤芍、当归、漏芦）合提后浓缩的浓缩液中延胡索乙素质量浓度相差很大，针对此现象以及延胡索乙素的性质，本实验采用HPLC等检测方法，拆方配对等研究方法，从醋延胡索以外其他成分的作用、浓缩时温度的影响这两个方面进行探究，以期为其他含有醋延胡索的复方的提取工艺的确定以及工艺指标的选择提供依据。

1 仪器药材与试剂

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司，LC-20AT 228-45001-38输液泵，SPD-20A 228-45003-38紫外检测器，20A 228-45003-91混合器）；BP211D电子分析天平（德国sartorius）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式多用真空泵 （巩义市予华仪器有限责任公司）；

1.2 试药 延胡索乙素对照品 （中国食品药品检定研究院，规格20 mg，纯度≥98%，批号110726-200409）；醋延胡素饮片 （购自成都市科伦中药饮片公司，经成都中医药大学生药学教研室卢先明教授鉴定为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥块茎的炮制品）；赤芍饮片、当归饮片、漏芦饮片均购自成都市科伦中药饮片公司，经成都中医药大学生药学教研室卢先明教授鉴定分别为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根菊科植物祁州漏芦RhaponticuMuniflorum（L.）DC.的干燥根；HPLC分析用甲醇为色谱纯 （上海安谱科学仪器有限公司）；超纯水（Millipore超纯水净化系统制得）；磷酸、三乙胺、氨水为分析纯 （成都市科伦化工试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 延胡索乙素的测定

2.1.1 色谱条件 WelchroMC18色谱柱（250 mM×4.6 nm，5μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺调pH值至6.0）（65∶35）为流动相，体积流量为1.0 mL/min，检查波长为280 nm，柱温为30℃，进样量10μL［3-5］。

2.1.2 标准曲线 精密称取延胡索乙素对照品5.29 mg，于100 mL棕色量瓶中用甲醇溶解定容，配成质量浓度为0.052 9 mg/mL的对照品溶液。精密吸取对照品溶液1、2、3、4、5、10 mL，置10 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，制成质量浓度为0.005 290、0.010 58、0.015 87、0.021 16、0.026 45、0.052 90 mg/mL的对照品溶液，按“2.1.1”项下HPLC条件，进样分析。以进样量 （x）对峰面积（y）作图，得到标准曲线图。其回归方程为y= 12.60×106x+1.186×104，r=0.999 8，n=6。延胡索乙素对照品在5.29～52.90μg范围内，进样量与峰面积间呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度试验 精密吸取延胡索乙素对照品溶液10μL，按“2.1.1”项下HPLC条件，重复进样6次，记录峰面积值，6次测定结果的RSD为1.25%。

2.1.4 回收率试验 精密称取醋延胡索适量6份，按 “2.2”项下供试品溶液制备方法处理，进行质量浓度测定，计算加样回收率，结果平均回收率为101.08%，RSD为1.52%。见表1。

2.2 复方中赤芍、当归、漏芦的配伍对延胡索乙素提取率的影响 复方的化学成分不是由组成复方的各单味药成分的简单加和，复方中化学成分的变化也不是某一个有效成分发生了变化，而是从整体上发生了变化。这种变化可能有量的变化，如各自主要成分的提取率，也可能有质的变化，如某些成分消失或新成分产生。故实验的第一步就是通过拆方配对研究的方法确认是复方中哪味药对延胡索乙素产生了干扰，并初步探讨产生干扰的原因。

表1 延胡索乙素加样回收率测定结果Tab.1 Recovery of tetrahyd ropalmatine

2.2.1 提取液的制备 称取醋延胡索饮片5份，每份6 g，按处方配伍比例称取赤芍、当归、漏芦饮片，制备5种供试品 （醋延胡索，醋延胡索配伍赤芍，醋延胡索配伍当归，醋延胡索配伍漏芦，醋延胡索配伍赤芍、当归、漏芦），5份饮片均加入10倍体积水，煎煮提取3次，每次1 h，合并提取液，定容到相同体积即得A组、B组、C组、D组、E组5种提取液，每种提取液平行制备3份。

2.2.2 提取液中延胡索乙素的测定 吸取相同体积的5种提取液10 mL，加入氨水-甲醇 （1∶20）50 mL，80 Hz超声30 min，抽滤，滤液蒸干后甲醇定容到10 ML，溶液3 500 r/min离心10 min，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样，测定峰面积，计算延胡索乙素质量浓度及提取率。实验结果见表2、图1。

表2 醋延胡索不同配伍组对延胡索乙素提取率的影响（n=3）Tab.2 In fluence to extraction yield of tetrahydropalmatine by formula alterations（n=3）

由表2可知，醋延胡索与赤芍、当归配伍提取时，延胡索乙素提取率显著降低。

2.3 配伍后延胡索乙素提取率降低的原因的探讨

图1 对照品、不同提取液及阴性对照色谱图Fig.1 HPLC chromatograMof reference substance，different extracts and negative control extract

2.3.1 配伍后提取液pH改变的影响的研究 由“2.2.2”项实验结果可知醋延胡索与不同药配伍延胡索乙素提取率差异很大。提取液中延胡索乙素主要以盐的形式存在，为强碱弱酸盐，部分以游离化合物存在。在水提液中延胡索乙素醋酸盐的溶解度高于游离延胡索乙素，但当溶液显碱性时，延胡索乙素醋酸盐向延胡索乙素转化，在提取液中很快形成饱和甚至过饱和溶液，致使延胡索乙素不能进一步溶出，从而质量浓度降低。因此醋延胡索单独提取和与其他药物配伍提取时提取液的pH可能是导致延胡索乙素质量浓度不同的原因之一。故实验的第二步就是精密测定各提取液pH，并分析延胡索乙素提取率与pH的关系。实验结果见表3。

表3 醋延胡索不同配伍组提取液pHTab.3 pH values of differen t extraction solution for vinegar-processed Corydalis yanhusuo Rhizoma in altered formulas

采用SPSS软件对不同配伍提取液的pH及延胡索乙素质量浓度结果进行统计分析。以延胡索乙素提取率为应变量 （Y），以pH为变量 （X），对两因素做曲线拟合，结果见图2。

图2 延胡索乙素提取率 （Y）与pH（X）曲线拟合图Fig.2 Curve fitting of extraction yield of tetrahydropalmatine（Y）and pH（X）

由表3可知5种提取液均呈酸性，且pH较接近 （5.47～6.74）。由图2可知延胡索乙素提取率与pH不具有相关性。以上实验结果表明在（5.47～6.74）的pH范围内，pH的大小对延胡索乙素提取率影响不大。醋延胡索与其他药物配伍提取导致延胡索乙素提取率降低是除pH以外其他因素的影响。

2.3.2 配伍后沉淀反应生成的研究 进一步观察本实验中延胡索乙素提取率最低的B组提取液发现有红棕色沉淀，将A组提取液、延胡索乙素对照品溶液分别与赤芍单提液混合，均产生红棕色沉淀；3种沉淀均不溶于水、三氯甲烷；微溶于丙酮、甲醇、乙醇，易溶于二甲亚砜；将两沉淀溶于酸性液中，碘-碘化铋钾、碘-碘化钾试管反应阳性，提示沉淀中有生物碱成分。所以初步推断是复方中其他药物所含成分与延胡索乙素发生沉淀反应从而对提取率产生了影响。

2.3.3 沉淀物化学组成的探讨 对B组提取液、赤芍单提液中芍药苷提取率进行测定，分别是92.96%、94.01%，实验结果表明二者没有显著性差异，初步推断可能是赤芍中芍药苷以外的其他物质对延胡索乙素的溶出产生了影响，且此物质在赤芍、当归中均含有。有研究表明［6］某些复方临床多用散剂的原因是酸碱物质重组生成水不溶性复合物使有效成分提取率降低，比如延胡索散中的生物碱与甘草酸反应生成沉淀导致生物碱质量浓度降低。有研究表明［7］延胡索的有效成分生物碱易与收涩类药物所含鞣质在水溶液中生成难溶性沉淀。赤芍、当归中均含有鞣质，且鞣质含有量赤芍大于当归［8-10］，与延胡索乙素提取率减少百分率的大小顺序对应，所以进一步推断是复方中其他药物所含鞣质与延胡索乙素发生沉淀反应从而降低了延胡索乙素提取率。后续实验中将鞣质溶液与延胡索乙素溶液混合，产生红棕色沉淀，其性质类似于“2.3.2”项下；对此红棕色沉淀与 “2.3.2”项下红棕色沉淀都进行鞣质鉴别反应，结果呈阳性。证明以上推断的正确性即复方中其他药物所含鞣质与延胡索乙素发生沉淀反应从而降低了延胡索乙素提取率。

2.4 浓缩方式对延胡索乙素转移率的影响 醋延胡索饮片中延胡索乙素含有量很低 （饮片全检结果是0.055%），当与其他药物配伍提取时因溶剂量较大从而导致提取液中延胡索乙素质量浓度较低。在前期实验时为使延胡索乙素峰面积适宜，对四味药合提的提取液进行测定之前采用了常压浓缩。有研究表明延胡索乙素具有热不稳定性［11］，所以实验的第二步是考察不同的浓缩方式对延胡索乙素转移率的影响。

2.4.1 浓缩液的制备 量取相同体积的 “2.2.1”项下E提取液6份，其中3份采用常压沸腾浓缩法浓缩，剩余3份采用60℃减压浓缩法浓缩。

2.4.2 浓缩液中延胡索乙素测定 吸取相同体积的两种浓缩液10 mL，加入氨水-甲醇 （1∶20）50 mL，80 Hz超声30 min，抽滤，滤液蒸干后甲醇定容到10 mL，溶液3 500 r/min离心10 min，上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样，测定峰面积，计算延胡索乙素质量浓度及转移率。实验结果见表4。

表4浓缩方式对延胡索乙素转移率的影响（n=3）Tab.4 Influence of different enrichment methods to extraction yield of tetrahydropalmatine（n=3）

由表4可知，常压浓缩与减压浓缩的延胡索乙素转移率均较高，且SPSS软件成组t检验结果表明两种浓缩方式之间差异无统计学意义。

3 讨论

赤芍、当归、漏芦对延胡索乙素提取率影响的实验结果表明：赤芍、当归所含鞣质对延胡索乙素的提取产生了影响，其中以赤芍影响最大。通过对以上文献及实验结果的综合分析，得出结论醋延胡索与赤芍配伍提取能生成沉淀，沉淀中有生物碱和鞣质，从而降低延胡索乙素提取率。生成沉淀的原因是鞣质为酸性物质，能与碱性的延胡索乙素相互结合，生成分子质量较大的水不溶性复合物［12］。实验结论提示对于既有赤芍又有醋延胡索的复方制剂，不宜采用液体剂型。传统上延胡索配伍当归、川芍、桂枝、赤芍是治疗血瘀疼痛的基本药物［13］，本实验结果反映了其多为固体剂型且能起到缓释作用的意义，同时为本复方新药研发时剂型的选择提供参考［7］。

浓缩方式对延胡索乙素转移率影响的实验结果表明醋延胡索与其他药物配伍提取浓缩时延胡索乙素转移率的降低与浓缩过程关系不大，主要是提取时其他药物成分的影响；减压浓缩与常压浓缩之间无显著性差异。

本实验曾对延胡索乙素测定的供试品溶液制备方法进行探索，分别用氨水-甲醇超声、三氯甲烷萃取［14］、乙醚萃取［15］进行制备，结果表明氨水-甲醇超声法较好，延胡索乙素转移率较高，故本实验均采用此制备方法。

本实验通过测定不同配伍水提液中延胡索乙素的量，发现醋延胡索与赤芍、当归配伍后，主要药效成分延胡索乙素量不同程度的减少，为探索方剂配伍规律，筛选和优化延胡索类复方制剂的配方以及为临床用药和新药开发提供了一定的科学依据。

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Effects of Paeoniae Rubrae Radix，Angelicae sinensis Radix and Rhapontici seu Echinops Radix on tetrahydropalmatine froMvinegar-processed Corydalis yanhusuo Rhizoma

GUO Zhi-ye1， HAN Li1*， YANGMing1，2， LIU Li-mei1， HE Jing1， ZOUWen-quan3

（1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory for Systematic Research and Development of Traditional Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，China；2.Key Laboratory for Modern TCMPreparations，Ministry of Education，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China；3.Sichuan University，Chengdu 610064，China）

vinegar-processed Corydalis yanhusuo Rhizoma；tetrahydropalmatine；co-extraction；Chishao（Paeoniae Rubrae Radix）；Danggui（Angelicae sinensisRadix）；Loulu（Rhapontici seu EchinopsRadix）；sediment

R284.2

：A

：1001-1528（2015）05-0981-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.012

2014-06-24

四川省科技支撑项目 （2014SZ0071-09）

郭志烨 （1988—），女，硕士，从事中药新技术、新工艺、新制剂研究。Tel：（028）61800127，E-mail：guozhiyejiayou@ 163.com

*通信作者：韩 丽 （1965—），女，教授，硕士生导师，从事中药新技术、新工艺、新制剂研究。Tel： （028）61800127，E-mail：hanliyx@163.com