白花蛇舌草注射剂抑制人肝癌细胞SMMC-7721 增殖及调控Bcl-2/CytC信号通路诱导线粒体凋亡

李文婷， 赵凤鸣， 戴紫函， 周 韬， 李沐涵， 吴勉华*

(1. 南京中医药大学 江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏 南京210023;2. 爱丁堡大学生物科学学院，英国EH9 3JR)

肝癌为常见的恶性肿瘤之一且在我国发病率较高，其病因迄今尚未阐明。肝癌目前以手术治疗、放疗、局部消融疗法、化疗等综合治疗，但整体预后仍不良。现代研究资料表明中草药白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、增强非特异性免疫和保护神经系统的作用。近年来因其在恶性肿瘤和炎性疾病中的显著效果［1］被广泛应用于临床，受到医药工作者的重视。实验证明白花蛇舌草对多种肿瘤细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用，如人胶质母细胞瘤U87 细胞［2］、多发性骨髓瘤RPMI 8226 细胞［3］、人乳腺癌MCF-7 细胞［4］、腹水瘤S180 细胞［5］等。李洁［6］等体内研究发现白花蛇舌草处理小鼠血道转移模型后，对肿瘤细胞血道转移有明显抑制作用，且呈剂量依赖性。刘智勤［7］等报道白花蛇舌草联合氟尿嘧啶5-Fu 作用于H22 荷瘤小鼠后，调节荷瘤小鼠胃肠和免疫功能，起到减毒增效的功能。

白花蛇舌草注射液作用于体内、体外均有良好的抗肿瘤效果，但其对肝癌的作用机制研究尚不明确。本实验选择人肝癌SMMC-7721 细胞作为研究对象，探讨白花蛇舌草对人肝癌SMMC-7721 细胞增殖凋亡及Bcl-2/CytC 信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 白花蛇舌草注射液购自吉林省通化振国药业有限公司，(国药准字Z22022101，产品批号130201，规格为每支装2 mL);注射用顺铂购自齐鲁制药(海南)有限公司(国药准字H20073652，产品批号1A1A1306026B，规格10 mg);DMEM/HIGH GLUCOSE 培养液、胎牛血清(FBS)、青链霉素混合液均购自Gibco 公司;胰酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Biosharp 公司;磷酸盐缓冲液 (PBS)购自Hyclone 公司;一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、CytC、β-actin 均购自Cell Signaling 公司，羊抗兔IgG 二抗购自Santa 公司。MTT 用PBS 溶液配制成浓度是5 mg/mL，4 ℃避光保存于冰箱，1 周弃用。

1.2 方法

1.2.1 细胞株及细胞培养 人肝癌细胞株SMMC-7721 购自南京凯基生物公司。将SMMC-7721 细胞培养于含10%胎牛血清、100 μg/mL 的青链霉素混合液的DMEM 培养液中，置于37 ℃、体积分数5%的CO2培养箱中培养。隔天换液，0.25%胰酶消化，调整细胞密度为1 ×105个/mL。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 噻唑蓝还原法(MTT 法)检测白花蛇舌草注射液对细胞增殖的影响 将SMMC-7721 细胞以每孔180 μL 接种于96 孔板中，加入白花蛇舌草注射液20 μL，终浓度分别为0 (空白对照)、25、50、100 μg/mL，阳性对照组加入顺铂20 μL，终浓度为4 μg/mL，每个药物浓度组各设6 个复孔。置于37 ℃，5% CO2及饱和湿度条件下细胞培养箱中孵育24、48 h 后加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，振荡2 min 混匀，继续培养4 h，弃孔内试剂，每孔加DMSO 150 μL，吸弃试剂，加入DMSO 溶液150 μL，轻轻振荡10 min，充分混匀后，放入酶标仪中，选取490 nm 波长测定每孔吸光度(OD)值。调零孔为200 μL DMEM 培养液。计算细胞增殖抑制率IR(%) =［1-(OD处理组-OD调零孔)/(OD空白对照组-OD调零孔)］×100%。

1.2.3 倒置显微镜观察结果 使用终浓度分别为0 (空白对照)、25、50、100 μg/mL 白花蛇舌草注射液及4 μg/mL顺铂作用于人肝癌SMMC-7721 细胞24 h 后，倒置显微镜下对每组SMMC-7721 细胞形态进行观察。

1.2.4 透视电镜观察结果 取对数生长期细胞加入白花蛇舌草注射液，使其终浓度为100 μg/mL，空白组加入DMEM 培养液后，放置于37 ℃，体积分数5% CO2细胞培养箱中孵育24 h 后，胰酶消化，1 000 r/min 离心10 min，去上清后沿离心管壁缓慢加入0.25%戊二醛固定。乙醇脱水后，采用LR White 包埋，切片，醋酸铀和柠檬酸铅双染色后，观察其内部结构的变化。

1.2.5 Western blot 法检测蛋白表达 将4 组(0、25、50、100 μg/mL)白花蛇舌草注射液和1 组4 μg/mL 顺铂分别作用细胞24 h 后，低温提取蛋白，蛋白定量，加入4 ×loading buffer，100 ℃变性5 min。采用12%的SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉置于摇床上室温封闭1 h，一抗按照1 ∶1 000 浓度在4 ℃中孵育过夜，TBST 洗膜3 次，各10 min，二抗按照1 ∶3 000 浓度配置，摇床上室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min，滴入ECL 显色剂，避光显色1 min 后放入凝胶成像系统中曝光，实验重复3 次。

1.2.6 统计学分析 应用SPSS 16.0 统计软件对数据进行统计处理。所得数据以均数±标准差(±s)表示。样本比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白花蛇舌草注射液对SMMC-7721 作用 白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721 细胞24、48 h 后，细胞存活率在50、100 μg/mL 浓度下显著下降。抑制率随药物浓度的增加和作用时间的延长而升高，呈现剂量和时间依赖关系，见表1。白花蛇舌草注射液在50 μg/mL 和100 μg/mL 浓度时对SMMC-7721 细胞具有明显的抑制作用(P ＜0.05)。本研究发现在25 μg/mL 浓度下白花蛇舌草注射液组具有促肿瘤增殖趋势。有文献报道具有抗肿瘤作用中药，在某些浓度下存在促进肿瘤生长作用。陈坤［8］等人报道一定体积分数的黄芪注射液具有促进人食管癌细胞珠TE-B 生长作用。本研究发现白花蛇舌草亦存在此现象，表明中药的使用上应注意其浓度，以充分发挥其抗肿瘤作用。

表1 白花蛇舌草注射液对人肝癌细胞增殖的影响(±s，n=3)

表1 白花蛇舌草注射液对人肝癌细胞增殖的影响(±s，n=3)

注:与空白对照组比较，* P ＜0.05

组别 质量浓度/(μg·mL -1 OD 值/(×10 -1抑制率/%24 h 48 h 24 h 48 h空白对照组 0 3.45 ±0.23 4.72 ±0.11 - -顺铂组 4 1.19 ±0.14* 0.88 ±0.15* 65.507 81.356白花蛇舌草注射液组 100 1.05 ±0.05* 0.97 ±0.13* 69.543 79.396白花蛇舌草注射液组 50 2.46 ±0.47* 2.59 ±0.13* 28.716 45.127白花蛇舌草注射液组 25 4.33 ±0.06* 6.25 ±0.21*))-25.526 -32.468

2.2 白花蛇舌草注射液对SMMC-7721 细胞形态的影响 不同剂量白花蛇舌草注射液作用后细胞形态存在差异，如图1。

由图1A 图可见空白对照组SMMC-7721 细胞形态呈现多边形或类三角型，紧密排列，胞质较透明。不同浓度(25、50、100 μg/mL)的白花蛇舌草注射液处理后，随着药物浓度的增加，细胞密度明显降低，数目减少，形态变得不规则。4 μg/mL 顺铂处理细胞后，细胞形态不规则，脱落，漂浮的细胞碎片增多。由图1D 图可见细胞出现萎缩、漂浮，细胞碎片增多，细胞膜边缘出现空泡等凋亡形态改变。图1E 细胞数目减少明显，可见大量脱壁、漂浮的细胞。由图可见100 μg/mL 白花蛇舌草注射液与4 μg/mL 顺铂作用于SMMC-7721 细胞后抑制细胞生长作用最为明显。

2.3 白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721 细胞超微结构变化由图2A 图可见，空白对照组细胞核较大，细胞核清晰，细胞器丰富，线粒体呈圆形或椭圆形，基质丰富，细胞核内染色质分布均匀。由图2B 可见白花蛇舌草注射液剂量为100 μg/mL 时，微绒毛脱落，胞质变性，出现空泡，细胞染色质固缩，边移，存在早期凋亡迹象。

2.4 白花蛇舌草注射液调控SMMC-7721 细胞Bcl-2/CytC 信号通路相关蛋白表达 Western blot 结果显示由图3 可见，100、50、25 μg/mL 白花蛇舌草注射液预处理细胞24 h，与对照组相比Bax、CytC、Caspase-3 蛋白表达逐渐加深，Bcl-2 蛋白表达逐渐减弱。Bcl-2/Bax 比值降低。其中100、50 μg/mL组效果最显著。提示白花蛇舌草注射液能上调人肝癌SMMC-7721 细胞Bax 蛋白表达，下调Bcl-2 蛋白的表达，降低Bcl-2/Bax 比值，释放CytC，激活Caspase-3 蛋白的表达，诱导肝癌细胞凋亡，见表2。

3 讨论

肝癌为常见的恶性肿瘤，其病程发展快，病人存活期短，预后多不良。我国属肝癌的高发地区，肝癌死亡率约占全世界肝癌死亡人数的45%。目前对肝癌的治疗以手术和化疗为主的综合治疗，但大剂量化疗药物的毒副反应使得病人的生存质量很差［9］。近年来，中医药抗肿瘤方面表现出的成效，使得人们将希望寄托在寻找副作用小且效果好的中药，因此寻找治疗肝癌的有效中成药显得十分迫切和有意义［10］。白花蛇舌在临床广泛使用，因其显著疗效，逐渐成为研究热点。本实验显示50、100 μg/mL 的白花蛇舌草注射液表现出抑制人肝癌SMMC-7721 细胞增殖的能力，且随着药物浓度的升高和时间的延长，抑制作用逐渐增强，呈现出剂量时间依赖性。

图1 各组SMMC-7721 细胞24 h 后形态学的变化(×400)

图2 电镜下观察各组人肝癌细胞超微结构变化

图3 各组Bax，Bcl-2，Caspase-3 和CytC 蛋白表达水平

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h 后Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC 蛋白表达的影响(±s，n=3)

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h 后Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC 蛋白表达的影响(±s，n=3)

注:与空白对照组比较，* P ＜0.05

组别 质量浓度/(μg·mL-1)Bax/β-actin Bcl-2/β-actin Caspase-3/β-actin Cyt-c/β-actin空白对照组0 0.35±0.03 0.22±0.02 0.07±0.01 0.12±0.04白花蛇舌草注射液组 100 0.56±0.02* 0.04±0.03* 0.17±0.02* 0.52±0.02*白花蛇舌草注射液组 50 0.48±0.03* 0.11±0.02* 0.09±0.02* 0.33±0.03*白花蛇舌草注射液组 25 0.34±0.04* 0.20±0.04* 0.22±0.04* 0.51±0.02*顺铂组 4 0.75±0.02* 0.18±0.04* 0.18±0.02* 0.42±0.03*

多数抗肿瘤药物以抑制肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡发挥抗肿瘤作用。形态学的改变可以直观发现药物处理后肿瘤细胞的变化［11］，本实验中白花蛇舌草注射液处理SMMC-7721 细胞后细胞出现萎缩、碎片、小气泡等凋亡形态改变，且存在剂量时间依赖性。透射电镜下可见白花蛇舌草注射液100 μg/mL 时，细胞出现微绒毛脱落，胞质变性，空泡，染色质固缩边移等早期凋亡迹象。本研究结果提示白花蛇舌草注射液可以通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导其凋亡发挥抗肿瘤作用。

细胞凋亡的途径主要有两条:外部途径称死亡受体通路，内部途径称线粒体通路，是以线粒体为核心介导细胞凋亡。线粒体信号通路调控细胞凋亡的作用十分明显［12］。线粒体作为第二主要功能的细胞器，参与细胞能量代谢并通过呼吸链作用生成ATP，与DNA 损伤、细胞衰老、细胞死亡等有关［13］。Bcl-2 家族在线粒体凋亡途径的调控中发挥重要作用。Bcl-2 家族包括以Bcl-2、Bcl-xL 为代表的抑制凋亡蛋白和以Bax、Bim 为代表的促进凋亡蛋白。这两类相反的蛋白质相互作用，可通过形成同源或异源二聚体来调节线粒体内信号传递系统，调节细胞凋亡［14］。Bcl-2 表达量减少，Bax 表达量增高，，则Bcl-2/ Bax 比值降低，，则细胞容易发生凋亡。目前，Bcl-2 家族成员凋亡的机制可能有:(1)Bax 可以破坏线粒体膜，引起细胞色素C (Cytochrome C，CytC)的释放，CytC 与凋亡蛋白酶活化因子(Apoptotic protease-activating factor，Apaf-1)结合成为多聚复合体从而激活Caspase-9，进一步强化了Caspase 级联反应，激活下游的Caspase-3，最终导致细胞凋亡［15］，而在细胞凋亡时Bcl-2的作用则与之相反; (2)在Bax 家族中，有抗凋亡蛋白，如:Bcl-2、Bcl-xL 与Bax 和Bcl-xL 与Bak 相互作用后可阻止Bax 或Bak 发生构象改变抑或阻止它们的寡聚化作用抑或阻止它们插入线粒体外膜，从而抑制细胞凋亡。线粒体凋亡通路在细胞凋亡中的作用至关重要，因此选择此通路进行研究。本研究发现白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721细胞24 h 后可以上调促凋亡蛋白Bax 的表达，下调抑凋亡蛋白Bcl-2 的表达，Bcl-2/Bax 比值降低，释放CytC 蛋白，最终激活Caspase-3 蛋白，从而诱导肝癌细胞凋亡，发挥体外抗肿瘤作用。

综上所述，白花蛇舌草注射液对人肝癌SMMC-7721 细胞有抑制增殖、诱导凋亡的作用。其作用机制可能与其调控Bcl-2/Cytc 线粒体凋亡信号通路相关。

［1］ 纪宝玉，范崇庆，裴莉昕，等. 白花蛇舌草的化学成分及药理作用研究进展［J］. 中国实验方剂学杂志，2014，20(19):235-240.

［2］ Zhang Y，Xie R F，Xiao Q G，et al. Hedyotis diffusa Willd extract inhibits the growth of human glioblastoma cells by inducing mitochondrial apoptosis via AKT/ERK pathways［J］. J Ethnopharmacol，2014，158(10):404-411.

［3］ 张 翔，周郁鸿，叶宝东，等. 白花蛇舌草注射液对多发性骨髓瘤细胞株增殖的抑制作用［J］. 中医杂志，2013，54(15):1319-1326.

［4］ Liu Z，Liu M，Liu M，Li J ，et al. Methylanthraquinone from Hedyotis diffusa WILLD induces Ca2+-mediated apoptosis in human breast cancer cells［J］. Toxicol In Vitro，2010，24(1):142-147.

［5］ 陈 玉，冯大刚，胡 荣，等. 半枝莲和白花蛇舌草总多糖对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究［J］. 新中医，2013，45(5):171-174.

［6］ 李 洁，孙 静，宋 健. 白花蛇舌草抗肝癌H22 小鼠血道转移的实验研究［J］. 时珍国医国药，2012，10(1):2434-2435.

［7］ 刘智勤，陈鹊汀，朱惠学，等. 白花蛇舌草对5-Fu 的增效减毒作用研究［J］. 时珍国医国药，2011，22 (1):142-144.

［8］ 陈 坤，高献书，卢付河，等. 黄芪、参芪促肿瘤生长作用的观察［J］. 河北医科大学学报，2004，25(1):33-34.

［9］ 周际昌. 实用肿瘤内科学［M］. 北京:人民卫生出版社，2010:611-617.

［10］ Zhou J，Zhou T，Jiang M ，et al. Research progress on synergistic anti-tumor mechanisms of compounds in Traditional Chinese Medicine［J］. J Tradit Chin Med，2014，34 (1):100-105.

［11］ Mahassni S H，Al-Reemi R M. Apoptosis and necrosis of human breast cancer cells by an aqueous extract of garden cress (Lepidium sativum)seeds［J］. Saudi J Biol Sci，2013，20(2):131-139.

［12］ Chaudhary P，Vishwanatha J K. c-Jun NH2-terminal kinase-induced proteasomal degradation of c-FLIPL/S and Bcl2 sensitize prostate cancer cells to Fas-and mitochondria-mediated apoptosis by tetrandrine［J］. Biochem Pharmacol，2014，91 (4):457-473.

［13］ Gao C，Ding Y，Zhong L，et al. Tacrine induces apoptosis through lysosome- and mitochondria-dependent pathway in HepG2 cells［J］. Toxicol In Vitro ，2014，28(4):667-674.

［14］ 於丙寅，孙 伟，涂 玥，等. 中药调控Bcl-2/Bax 信号通路干预肾脏固有细胞凋亡研究进展［J］. 河南中医，2014，34(6):1197-1199.

［15］ Zorofchian Moghadamtousi S，Karimian H，Rouhollahi E，et al.Annona muricata leaves induce G1 cell cycle arrest and apoptosis through mitochondria-mediated pathway in human HCT-116 and HT-29 colon cancer cells［J］. J Ethnopharmacol，2014，156(10):277-289.