HPLC 法同时测定不同产地、采收期、部位广东紫珠中的熊果酸和齐墩果酸

房海灵， 聂 韡， 卢艳花， 朱培林*

(1. 江西省林业科学院，江西 南昌330032;2. 华东理工大学，上海200237)

广东紫珠Callicarpa kwangtungensis Chun. 为马鞭草科紫珠属多年生落叶灌木植物［1］，以干燥茎枝和叶入药，在我国用药历史相对较短，以“万年青”之名始载于清代《植物名实图考》［2］，被《中国药典》2010 年版收载［3］，具有收敛止血、散瘀、清热解毒之功效，临床上常用于治疗宫颈糜烂出血、阴道炎、宫颈炎等症［4］。研究表明，广东紫珠的主要化学成分为黄酮、苯乙醇苷、萜类及挥发油等［5-8］，其中三萜类化合物(如熊果酸、齐墩果酸等)具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和降血糖等药理作用［9］，属于活性物质，与该植物的主要功效相符，因而有必要对其进行质量控制。目前，国内对该药材质量的研究主要集中在苯乙醇苷类化合物含有量的测定方面［10-11］，鲜有三萜类化合物测定的相关报道［12］。本实验采用HPLC 法，对不同产地、采收期、部位广东紫珠中熊果酸和齐墩果酸的含有量进行测定，为全面控制其质量奠定基础。

1 仪器与试药

Waters 2695 HPLC 色谱仪，包括真空脱气机、自动进样器、柱温箱、Waters 2468 紫外光检测器、Empower 色谱工作站(美国Waters 公司)。熊果酸(批号110742-200518，纯度95%)、齐墩果酸(批号110709-200505，纯度95%)对照品(中国食品药品检定研究院)。各批次药材经江西省林业科学院森林药材与食品研究所朱培林研究员鉴定，均为广东紫珠C. kwangtungensis 的地上部分。甲醇为色谱纯(德国Merck 公司);水为超纯水(自制);其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ZOBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液(90∶10);体积流量1 mL/min;检测波长210 nm;柱温25 ℃;进样量20 μL。理论塔板数按熊果酸峰计算，不低于5 000。在此色谱条件下，样品中熊果酸和齐墩果酸能达到基线分离，见图1。

图1 对照品和供试品的HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取熊果酸、齐墩果酸对照品适量，加甲醇溶解，制成对照品母液。再分别吸取母液适量，置于同一量瓶中，加甲醇定容，得到质量浓度分别为52.40、55.36 μg/mL的混合对照品溶液，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒定质量的广东紫珠粉末(过100 目筛)1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入乙醇40 mL，称定质量，冷浸4 h，超声(150 W、40 kHz)40 min，放冷，乙醇补足减失的质量，摇匀。过滤后，药渣按相同方法重复提取2 次，合并滤液，浓缩，乙醇定容至40 mL，0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1、4、8、16、20 μL，在“2.1”项色谱条件下测定，以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，得到熊果酸的标准曲线回归方程为Y =436 428X -18 545 (r =0.999 8);齐墩果酸为Y =469 748X -18 730 (r =0.999 8)。结果表明，两者分别在0.052 4 ～1.048、0.055 ～1.107 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20 μL，重复进样5 次，在“2.1”项色谱条件下测定各对照品峰面积。结果，熊果酸、齐墩果酸峰面积RSD (n=5)分别为0.3%、0.6%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 精密称取江西井冈山产广东紫珠粉末5 份，每份1.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL 进样，测定峰面积。结果，熊果酸、齐墩果酸峰面积RSD 分别为0.8%、0.9%，表明该方法具有较好的重复性。

2.6 稳定性试验 精密称取江西井冈山产广东紫珠粉末1.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，测定峰面积。结果，熊果酸、齐墩果酸峰面积RSD 分别为0.8%、0.7%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 分别称取各成分含有量已知的江西井冈山产广东紫珠粉末5 份，每份0.5 g，精密加入含熊果酸0.43 mg、齐墩果酸0.265 mg 的乙醇溶液40 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定峰面积，结果见表1。

表1 加样回收试验结果Tab.1 Result of recovery tests

2.8 样品测定 分别取不同产地、采收期、部位的广东紫珠粉末适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL，注入HPLC 色谱仪，在“2.1”项色谱条件下进样分析，测定峰面积，用外标法进行计算，结果见表2 ～4。

3 讨论

本实验考察了不同提取溶剂 (45%、70%、100%乙醇，50%、100% 甲醇)以及水浴回流、索氏、超声等不同提取方法，发现乙醇提取的效果最佳。同时，还考察了以乙醇为提取溶剂，在不同提取时间 (40、50、60 min)、料液比 (1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50)、温度 (50、60、70 ℃)、次数(1、2、3 次)时的提取效果。结果表明，以乙醇为提取溶剂、料液比1 ∶40、在60 ℃下超声40 min、提取两次时，提取较完全，而且该方法稳定、重复性好。

在流动相系统的选择方面，张光贤［15］报道了采用HPLC 法(流动相为甲醇-1.0% 冰醋酸水溶液)进行定量测定，但分离度不理想。本实验考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液这3 个系统，发现以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相时，所得色谱峰峰形较好，分离效果最佳。同时，还考察了该流动相的3 个比例(95 ∶5、90 ∶10、82 ∶18)，发现当其比例为90 ∶10时，在20 min 内出峰，保留时间合适，分离效果理想。因此，选择甲醇-0.1% 磷酸水溶液(90 ∶10)作为流动相。

表2 不同产地广东紫珠的测定结果(n=3)Tab.2 Determination result of C.kwangtungensis from different growing areas (n=3)

表3 不同采收期广东紫珠的测定结果(n=3)Tab.3 Determination result of C. kwangtungensis in different picking times (n=3)

表4 广东紫珠不同部位的测定结果(n=3)Tab.4 Determination result of C. kwangtungensis in different parts (n=3)

熊果酸与齐墩果酸为同分异构体，在天然植物中往往共生互存，结构与性质极其相似，故分离测定较为困难。早期研究采用薄层扫描色谱法测定［13］，但是易受操作环境及手法等因素影响，导致定量分析结果有所偏差。为此，本实验在文献［12，14-15］的基础上，结合实际情况，建立了同时测定广东紫珠中熊果酸和齐墩果酸含有量的方法，为系统评价该植物的质量提供理论依据。通过对17 个产地药材中这两种成分含有量的分析，发现均以熊果酸为高，约为齐墩果酸的1.5 ～2.5 倍，相差较大。因此，应注意提高药材内在性质的稳定性，保证临床用药的安全性和有效性。

同时，本实验还测定了江西芦溪6 月至11 月广东紫珠中熊果酸和齐墩果酸的含有量。结果表明，在该植物生长发育的不同阶段，两者存在显著性差异，其含有量的动态积累存在一个由高到低的趋势，并且在9 月份最高。另外，又比较了该药材不同部位中两者的含有量，发现在果实中最高，而在根中最低。因此，该方法可应用于工业化生产中，并根据不同的生产目的对植物原料进行采收，具有重要的现实意义和参考价值。

［1］ 中国科学院《中国植物志》编辑委员会. 中国植物志:第65 卷［M］. 北京:科学出版社，1982:74.

［2］ 清·吴其浚. 植物名实图考［M］. 上海:商务印书馆，1957:205.

［3］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草:第7册［M］. 上海:上海科学技术出版社，1999:801.

［4］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］. 北京:中国医药科技出版社，2010:40.

［5］ 周伯庭，李新中，徐平声，等. 广东紫珠地上部位化学成分研究(Ⅰ)［J］. 中南药学，2004，2(4):238-239.

［6］ Xie E L，Zhou G P，Ji T F，et al. A novel phenylpropanoid glycoside from Callicarpa kwangtungensis Chun. ［J］. Chin Chem Lett，2009，20:827-829.

［7］ 陈艳华，冯 锋，任冬春，等. 广东紫珠地上部分的化学成分［J］. 中国天然药物，2008，6(2):120-122.

［8］ 贾 安，杨义芳，孔德云，等. 广东紫珠超临界提取物的GC-MS 成分分析及体外抗菌活性［J］. 中国医药工业杂志，2012，43(3):178-181.

［9］ 熊 斌，雷志勇，陈 虹. 熊果酸药理学的进展［J］. 国外医学:药学分册，2004，6(31):133-136.

［10］ 周国平，谢二磊，盛杰曹，等. HPLC 法同时测定江西不同产地广东紫珠药材中连翘酯苷B 和金石蚕苷的含量［J］.药物分析杂志，2008，28(10):1623-1625.

［11］ 刘灿黄，刘塔斯，罗晨曲，等. 广东紫珠不同产地、不同部位中连翘酯苷B 和金石蚕苷含量的测定［J］. 中国中药杂志，2013，38(19):3324-3326.

［12］ 张光贤，蔡其辉，田宏现，等. RP-HPLC 法测定广东紫珠中熊果酸、齐墩果酸的含量［J］. 中华医学实践杂志，2007，6(8):721-722.

［13］ 许凤鸣，王兆全，朱 元. 薄层扫描法测定消渴康颗粒中熊果酸的含量［J］. 中国实验方剂学杂志，1998，4(4):51-52.

［14］ 麻秀萍，蒋朝晖，丁 宁，等. HPLC 测定马鞭草中熊果酸的含量［J］. 中成药，2005，27(1):88-90.

［15］ 徐 君，吴连花，徐文芬，等. HPLC 法测定对坐叶药材中齐墩果酸和熊果酸［J］. 中成药，2012，34(4):765-767.