多发性肌炎患者FAS／FASL抗原的表达与外周血淋巴细胞亚群的相关性研究①

揭旭日，王小超，黄丹，李红文，吕丽娜，陈红，左瑶

（右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000 E－mail：121943444＠qq.com）

多发性肌炎（PM）是特发性炎症性肌病的一种，以四肢近心端肌无力为主的骨骼肌非化脓性炎症性疾病。大多数患者伴发自发性肌痛、握痛，生化检查发现血清肌酸激酶（CK）升高，肌电图多出现肌源性改变。骨骼肌活检病理检查，可见肌纤维变性、坏死、肌细胞萎缩和纤维化或被脂肪组织替代［1］。PM／DM 的发病可能与病毒感染、遗传因素、体液免疫、细胞免疫、MHC－Ⅰ分子的表达及多种细胞因子有关［2－3］，我们在临床工作中发现，PM 患者激素治疗好转，但停药易复发，甚至有部分患者应用激素治疗无任何疗效、病情急剧加重，加用甲氨蝶呤、环磷酰胺或吗替麦考酚酯等免疫抑制剂治疗，甚至应用生物制剂CD20单抗治疗，疗效仍不佳，因而有必要对PM 患者肌细胞凋亡与体液免疫、细胞免疫的相关性进行研究，为揭示PM 肌细胞凋亡与人体细胞免疫、体液免疫的相关性做出贡献，为临床发现新的有效治疗PM 药物提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2012年10月～2014年10月接诊的PM 患者为研究对象，诊断均符合1975 年Bohan／Peter关于皮肌炎的诊断标准［4］，均为活动期患者。对照组为非骨骼肌疾病者，主要为四肢外伤需手术治疗的排除合并骨骼肌慢性疾病者，均于研究开始前签署知情同意书。研究组，男性7例，女性10例，平均年龄（41.76±11.84）岁；对照组，男性10例，女性10例，平均年龄（42.15±8.13）岁；所有研究对象均不合并严重的心、肝、肾等器质性疾病及免疫性疾病，且8周内未服用免疫抑制剂。两组在年龄、性别构成比等方面的差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 组织活检制备方法 所有研究对象均取上肢或下肢近心端肌纤维5g，经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，待检。

1.2.2 淋巴细胞亚群检测方法 所有研究对象均于清晨空腹抽取静脉血5ml，采用我院流式细胞仪测定其外周血CD3＋、CD4＋、CD19＋、CD8＋、NK 细胞细胞百分比及辅助性T 细胞和抑制性T 细胞比值，并做组间比较，分析其与病情活动情况的关系，具体操作方法按实验室规程进行。

1.3 免疫组化检测方法

1.3.1 切片制作 行石蜡包埋后制成4μm 石蜡切片3张，行免疫组化染色。

1.3.2 抗体检测 兔抗人FAS 和FASL 多克隆抗体、LSAB药盒购自上海卓康生物科技有限公司，实验过程：采用结合微波脱交联的LSAB 法，所有实验步骤均按试剂盒实验说明书进行。具体如下：4μm 切片载于玻片上，在56 ℃孵箱中干燥过夜，二甲苯梯度酒精水化，置标本于枸橼酸溶液中，于微波炉中处理8 min后取出，室温下自然冷却，分别在蒸馏水及PBS溶液中洗两次，滴3%H2O2及DAKO 药盒阻断液处理8min，滴10%正常牛血清于37 ℃室温放置10 min，阻断非特异性蛋白结合点，之后PBS 液冲洗3次，滴加稀释的一抗，其中FAS抗原在室温中孵育30 min，FASL在4℃湿盒中过夜，再经PBS洗3次，滴加标记的多聚HRP，于室温放置25 min后PBS冲洗3次，滴加DAB液，显色后用苏木素复苏。

结果判断：在标本染色过程中，加入由卓康生物科技有限公司提供的切片作为阳性对照（＋＋＋），用PBS替代一抗作为阴性对照。根据肌肉纤维着色的深浅及着色细胞占总细胞数的百分比，将其分为4个等级：－ ：无阳细胞；＋：阳性细胞＜20%；＋＋：阳性细胞占20%～50%；＋＋＋：阳性细胞＞50%。

1.4 统计学方法 所有数据均采用SPSS 15.0统计学软件进行分析，两组构成比资料采用秩和检验分析，计量资料采用两样本均数比较的t 检验分析，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理形态学改变 PM 肌肉组织活检，经HE 染色后在光镜下均可见到肌纤维肿胀，横纹肌消失，肌浆透明化，肌纤维膜细胞核增多，肌组织内炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。对照组肌肉组织活检，经HE染色后在光镜下均可见到肌纤维正常，肌组织周围有炎症细胞浸润，亦以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润。

2.2 FAS、FASL在PM 不同部位的表达差异 FAS抗原在PM 肌纤维表面及浸润的淋巴细胞均有较强的表达，而正常对照组则为低表达，PM 与对照组相应阳性率比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；FASL抗原在PM 肌纤维表面及浸润的淋巴细胞均有较强的表达，而正常对照组则为低表达，两组相应阳性率比较，差异均有统计学意义（P ＜0.01），见表1、表2。

表1 FAS在PM 标本中的表达 （n，%）

2.3 两组外周血淋巴细胞亚群细胞百分比对比 CD4＋、CD8＋细胞百分比高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），CD4＋／CD8＋比值高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表3。

表2 FASL 在PM 标本中的表达 （n，%）

表3 PM 组及对照组T、B淋巴细胞亚群、NK 细胞检测结果 （±s，%）

表3 PM 组及对照组T、B淋巴细胞亚群、NK 细胞检测结果 （±s，%）

组别 n CD3＋ CD4＋ CD8＋ CD19＋ NK CD4＋／CD8＋PM 组 17 66.43±8.83 41.63±8.38 22.01±3.19 11.4±9.47 21.55±2.71 2.00±0.62对照组 20 69.86±7.68 36.89±4.14 19.41±3.65 16.01±5.16 23.40±48.11 1.63±0.40 t 1.264 2.233 2.339 1.794 0.158 2.189 P 0.215 0.032 0.013 0.073 0.875 0.035

3 讨论

PM 是细胞免疫介导的针对肌纤维的自身免疫反应，是T 细胞介导的细胞免疫反应，它的靶器官是肌纤维。我们检测PM 患者外周血淋巴细胞亚群，发现其CD4＋、CD8＋T 细胞百分比均高于对照组，CD＋／CD8＋的比值亦高于对照组，此结果与张士发等［5］的研究结果相同。而CD4＋T 细胞具有辅助／诱导功能，CD8＋T 细胞具有抑制／细胞毒功能，从本研究结果分析，CD4＋、CD8＋T 细胞百分比均高于对照组，提示PM 患者CD4＋、CD8＋T 细胞均参与细胞免疫作用，至于CD4＋／CD8＋的比值亦高于对照组，可能为PM患者由CD4＋T 细胞介导的以诱导功能为主的作用更强于CD8＋T 细胞的细胞毒作用，这与张士发等［5］的观点又有不一致之处。目前临床上对PM 淋巴细胞亚群变化的研究和检测尚不多，且结论也不尽一致［6－7］，这均说明了免疫性疾病作用机制的复杂性。

FAS／FASL一直以来被认为是细胞介导程序死亡的通路［8］，近年关于凋亡机制是否参与肌细胞的坏死及凋亡相关因子在PM／DM 发病中的作用受到许多学者的关注［9］，本研究FAS／FASL蛋白在PM 患者中明显表达，与文献研究相符［10］，说明PM 患者肌纤维及其周围组织促进细胞凋亡的活性是活跃的，结合我们研究发现PM 患者免疫失调以CD4＋、CD8＋细胞免疫功能亢进为主，其中CD4＋T 细胞介导的诱导功能更强于CD8＋T 细胞的细胞毒作用，说明PM 患者诱导肌细胞凋亡及细胞毒作用至肌细胞死亡、肌细胞周围炎症反应同时存在，可能CD4＋T 细胞介导细胞免疫与FAS／FASL蛋白的促进肌细胞凋亡关系更加密切，但促进PM 患者肌纤维肿胀、横纹肌消失的因素可能尚有其他更强信号分子作用。

［1］ 粟占国，张奉春，曾小峰.风湿免疫高级教程［M］.北京：人民军医出版社，2013：130－131.

［2］ 郝伟丽.免疫因素在特发性炎症性肌病中的作用机制［J］.皮肤病与性病，2010，32（2）：17－19.

［3］ 吴蔚，尤敏，赵建华，等.皮肌炎患者外周血单个核细胞IL－17mRNA 的检测及临床意义［J］.实用医学杂志，2012，28（11）：1813－1815.

［4］ Bohan A，Peter JB.Polymyositis and dermatomyositis［J］.N Engl J Med，1975，292（8）403－405.

［5］ 张士发，梁再赋，周丽娟，等，多发性肌炎／皮肌炎患者外周血T 细胞亚群的检测［J］.细胞与分子免疫学杂志，2003，19（2）：204－205.

［6］ Ishii W，Matsuda M，Shimojima Y，et al.Flow cutomeric analysis of lymphocyte subpopulations and Th1／Th2balance in patients with polymyositis and dermatomyositis［J］.Inter Med，2008，47（18）：1593－1599.

［7］ Alekaza M，Szegedi A，Antal－Szalmas P，et al.Altered cytokine expression of peripheral blood lymphocytes in polymyosits and dematomysitis［J］.Ann Rheum Dis，2005，64（10）：1485－1489.

［8］ 刘丽萍，涂响安，赵志毅，等.食管癌Fas和bcl－2蛋白和DNA 含量的定量研究［J］.右江民族医学院学报，2002，24（2）：186－188.

［9］ Sahin M，Aydintug O，Tunc SE，et al.Serum soluble Fas levels in patients with autoimmune rheumatic diseases［J］.Clin Biochem，2007，40（1－2）：6－10.

［10］ 周红雨，方跃，唐颖.FAS／FASL抗原在多发性肌炎和皮肌炎的表达［J］.华西医学，2003，18（1）：45－46.