桃金娘根中没食子酸和总多酚含量测定

银慧慧 刘 伟 姜源明 孟 菲 覃振华 郭善康 赵 武 孙建华

广西壮族自治区兽医研究所袁广西畜禽疫苗新技术重点实验室袁广西南宁530001

桃金娘根中没食子酸和总多酚含量测定

银慧慧 刘 伟 姜源明 孟 菲 覃振华 郭善康 赵 武 孙建华

广西壮族自治区兽医研究所袁广西畜禽疫苗新技术重点实验室袁广西南宁530001

目的测定桃金娘根中没食子酸和总多酚的含量。方法没食子酸的含量测定采用超高效液相色谱法。色谱条件院以甲醇-0.5%磷酸(15︰85)为流动相袁采用二级管阵列检测器(PDA)检测袁检测波长为215 nm袁流速为0.2 mL/min。总多酚的含量测定采用分光光度法袁以没食子酸为对照品袁福林酚试剂为显色剂袁在748 nm波长下进行测定。结果没食子酸在3.853~115.6滋g/mL(r=0.9999)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系袁回收率为98.73%~100.76%。总多酚分析的线性范围为1.0~7.0滋g/m L(r=0.9995)袁回收率为98.04%~101.17%。结论该方法简便尧快速尧重现性好袁可用于桃金娘根的质量控制及定量分析。

桃金娘根；没食子酸；总多酚；超高效液相色谱法；分光光度法

桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa(Ait.)Hassk]是一种优良的野生植物资源袁尤盛产于中国和日本的南部等地区[1-2]曰桃金娘根(Radix Rhodomyrti)为桃金娘的干燥根袁含有黄酮苷尧花色苷等黄酮类成分以及植物多糖成分和没食子酸等化合物多种活性成分[3-5]袁以野通经活血尧收敛止血冶功效收载于叶兽药国家标准(化学药品尧中药卷)第一册曳中[6]。没食子酸是可水解鞣质的组成部分[7-8]袁具有抗感染尧抗突变尧抗氧化等多种生物学活性[9-10]。

桃金娘根药材及饮片质量标准首次收载于农业部叶兽药规范曳1992版二部[11]袁并未收入以后各版叶中国兽药典曳袁该质量标准一直沿用至今[12]。该质量标准相对比较简单袁专属性不强袁也不够全面袁未对其所含特征性生物活性成分进行色谱法鉴别袁也未建立科学尧准确尧灵敏的光谱袁色谱及质谱等方法对特征化学成分进行含量测定。因此袁测定桃金娘根中没食子酸和总多酚含量并对其进行质量评价袁为深入研究其药物作用机制具有重要意义。本文采用超高效液相色谱法[13-15]和分光光度法分别测定桃金娘根中没食子酸和总多酚的含量袁方法简单快捷袁重现性好袁可作为桃金娘没食子酸尧桃金娘多酚等特征性化学成分定性鉴别或定量检测的一种方法袁从而完善桃金娘中药材质量标准袁加强桃金娘根药材或饮片的质量控制。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Waters Acquity超高效液相色谱带二级管阵列检测器(photo-diode-array袁PDA)袁EmpowerTM3色谱工作站袁配BEH C18色谱柱(2.1 mm伊100 mm袁1.7滋m)(美国Waters公司)曰UV2550紫外-可见分光光度计(日本岛津)曰SK7200HP型超声波清洗器(上海科导)曰Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)曰SQP型(精度0.01 mg)电子天平(德国Sartorious公司)曰CAP225D型(精度0.1mg)电子天平(德国Sartorious公司)。

1.2 试剂

甲醇(色谱纯袁美国Tedia公司)袁0.2滋m混合滤膜(美国Waters公司)曰没食子酸对照品(逸98%袁北京恒元启天化工技术研究院尧北京世纪奥科生物技术有限公司联合研制)曰福林酚试剂(0.5 mol/L袁上海荔达生物科技有限公司)曰磷酸(分析纯袁广东光华科技股份有限公司)曰桃金娘根药材院玉林1尧2尧3号(产地广西玉林袁经广西植物研究所温放副研究员鉴定)曰水为超纯水。

图1 没食子酸对照品和桃金娘根供试品的超高效液相色谱图

表1 桃金娘根中没食子酸和总多酚含量(mg/g袁n=3)

2 方法与结果

2.1 没食子酸测定

2.1.1 色谱条件色谱柱院WatersBEHC18色谱柱(2.1mm伊100 mm袁1.7滋m)曰流动相院甲醇-0.5%磷酸(15颐85)曰流速院0.2mL/min曰检测波长院215 nm曰进样量院1滋L[16]。

2.1.2 标准溶液的配制取没食子酸对照品适量袁精密称定袁置棕色容量瓶中袁加甲醇制成浓度为115.6滋g/m L的标准储备液袁放4益冰箱备用。

2.1.3 标准曲线的绘制将没食子酸对照品溶液按不同倍数稀释袁按野2.1.1冶项下条件对不同浓度的没食子酸标准溶液进行色谱分析测定袁以没食子酸峰面积(Y)对质量浓度(X)进行回归分析袁得到回归方程和相关系数为院Y=21040X+4663.4袁r=0.9999(n=6)。结果表明袁没食子酸在3.853~115.6滋g/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。对57.80滋g/mL没食子酸标准溶液进行平行测定(n=6)袁峰面积和峰高迁移时间的RSD分别为0.9%和1.1%。图1A是没食子酸标准样品的超高效液相色谱图。

2.1.4 供试品溶液制备及没食子酸含量的测定供试品溶液制备院桃金娘根药材袁打粉袁过五号筛袁取0.3 g细粉袁精密称定袁置于100 mL具塞锥形瓶中袁精密加入50mL甲醇袁称定重量袁超声(350W袁53 kHz袁30益)提取40min袁放冷袁再称定重量袁用甲醇补足减失的重量袁摇匀袁过滤袁放4益冰箱备用。含量测定时过0.2滋m滤膜后供测试用。没食子酸含量测定院在野2.1.1冶色谱条件下对供试品溶液进行检测袁根据标准曲线计算没食子酸含量。样品分析色谱图见图1B袁桃金娘根中没食子酸含量见表1。

2.1.5 精密度试验取桃金娘根药材(玉林1号)粉末0.3 g袁精密称定袁按野2.1.4冶制备供试品溶液袁进样量为1滋L袁重复进样6次袁测定没食子酸峰面积袁并计算没食子酸含量袁测得没食子酸含量的RSD为1.1%。

2.1.6 稳定性试验取桃金娘根药材(玉林1号)粉末0.3 g袁精密称定袁按野2.1.4冶制备供试品溶液袁在室温下保存袁分别于0尧1尧2尧4尧6尧8尧24尧36尧48 h测定没食子酸的峰面积袁测得没食子酸含量的RSD为0.8%袁表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.1.7 回收率试验精密称取已知没食子酸含量的桃金娘根样品(玉林1号)9份袁分别向每份添加一定浓度的没食子酸标准溶液袁每个浓度制备三份平行样品袁测定其回收率袁结果见表2。

2.2 总多酚含量分析

2.2.1 实验方法采用紫外-分光光度法对桃金娘根中总多酚进行检测[17]。精密吸取待测样品溶液100滋L于10mL容量瓶中袁加入3mL超纯水袁摇匀袁再加入0.5mL福林酚试剂袁充分摇匀。1 min后再加入2.5 m L 20% Na2CO3溶液袁用超纯水定容至刻度袁混匀。25益下避光反应90 min后袁以显色剂为空白袁在748 nm波长处测定吸光度A(没食子酸对照品和桃金娘根供试品吸收光谱图见图2)。根据标准曲线袁计算出桃金娘根总多酚的含量。

表2 桃金娘根没食子酸回收率试验结果(n=3)

图2 没食子酸对照品和桃金娘根供试品的吸收光谱图

2.2.2 对照品溶液的配制和标准曲线的绘制取没食子酸对照品适量袁精密称定袁置棕色容量瓶中袁用超纯水溶解袁配制成浓度为98.8滋g/mL标准储备液。分别精密吸取对照品溶液0尧0.1尧0.3尧0.5尧0.7mL置于10mL棕色容量瓶中袁按野2.2.1冶项进行显色和测定袁以吸光度A为纵坐标袁浓度C为横坐标袁进行回归分析得到线性回归方程院A=0.0953C+0.0738袁r=0.9995(n= 6)。结果表明袁没食子酸含量在1.0~7.0滋g/mL范围内呈现良好线性关系。

2.2.3 供试品的配制和含量分析供试品溶液制备院桃金娘根药材袁打粉袁过五号筛袁取0.3 g细粉袁精密称定袁置于100mL具塞锥形瓶中袁精密加入50mL甲醇袁称定重量袁超声(350W袁53 kHz袁30益)提取40 min袁放冷袁再称定重量袁用甲醇补足减失的重量袁摇匀袁过滤袁放4益冰箱备用。含量分析院同野2.2.1冶试验方法项下进行显色和测定。根据标准曲线计算总多酚含量袁桃金娘根中总多酚含量见表1。

2.2.4 精密度试验取桃金娘根样品(玉林1号)按上述样品溶液配制方法及测定方法袁测定吸光度值袁重复测定6次袁RSD为0.87%。表明该比色法具有较高的精密度袁重复性好袁可以满足桃金娘根中总多酚分析的要求。

2.2.5 稳定性试验评价该比色法在一段时间内的稳定性袁取桃金娘根样品(玉林1号)按上述样品溶液处理方法及测定方法袁待比色体系完全反应后袁在25益下继续放置30尧60尧90尧120尧150min袁然后测定吸光度值袁随着时间的延长袁其值有下降趋势袁但幅度不大袁RSD为1.0%。

2.2.6 回收率试验精密称取已知总多酚含量的桃金娘根样品(玉林1号)9份袁分别向每份添加一定浓度的没食子酸标准溶液袁每个浓度制备三份平行样品袁按野2.2.1冶方法显色和含量测定袁计算回收率袁结果见表3。

表3 桃金娘根总多酚回收率试验结果(n=3)

3 讨论

桃金娘是中国南方地区民间传统习用中草药袁味甘尧涩尧平袁具有清热解毒尧收敛止泻尧理气止痛尧祛风活络尧祛瘀止血尧安胎功效袁常用于急尧慢性肠胃炎袁消化不良袁痢疾袁腹泻袁呕吐泄泻袁脘腹疼痛等临床病症。随着桃金娘化学成分研究不断深入和综合开发力度不断加大袁桃金娘化学成分及生物活性研究取得广泛的研究成果曰鞣酸及多酚类是桃金娘中药材主要有效化学成分之一袁具有收敛尧止泻袁抗菌尧抗病毒尧抗肿瘤和抗氧化等生物活性[12]。

采用超高效液相色谱法检测桃金娘根中没食子酸含量。对供试品溶液色谱图中没食子酸色谱峰进行纯度检查袁并与光谱库进行匹配袁结果显示袁色谱峰纯度角小于纯度阈值袁表明供试品溶液中1.927min处的峰为单一峰曰匹配角度小于匹配阈值袁表明供试品溶液中相应色谱峰的光谱与没食子酸光谱库的光谱非常相似袁可认为是同一物质。测得玉林桃金娘根药材中没食子酸含量分别为1.73尧1.48尧1.65 mg/g。采用福林酚试剂法和紫外-分光光度法测定桃金娘根中总多酚袁含量分别为79.21尧67.19尧74.33 mg/g。资料表明袁本试验是对桃金娘没食子酸尧总多酚进行的首次定量分析研究。

中药材及饮片的质量标准是保证中药材及饮片质量袁体现中药行业管理技术水平先进程度的重要标志曰制订与国际医药行业接轨的中药材质量标准是促进中药材走向国际市场尧实现中药材现代化的有效途径。本试验建立的检测桃金娘没食子酸超高效液相色谱检测技术和总多酚含量紫外-分光光度检测技术袁方法科学尧灵敏度高尧快速尧重复性好袁可作为桃金娘没食子酸尧桃金娘多酚等特征性化学成分定性鉴别或定量检测的一种方法袁从而完善桃金娘中药材质量标准袁加强桃金娘根药材或饮片的质量控制。同时袁随着桃金娘化学成分和生物活性研究的不断深入袁汇集化学成分-药效-药理研究成果袁研究更能全面反映桃金娘药材内核本质的色谱或光谱指纹图谱袁对桃金娘中药材种植尧采制尧流通规范化和质量管理的科学化及深入开发桃金娘新制剂均有深远意义。

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Determ ination of gallic acid and total polyphenol in Radix Rhodom yrti

YIN Huihui LIUWei JIANG Yuanming MENG Fei QIN Zhenhua GUO Shankang ZHAOWu SUN Jianhua
Veterinary Institute of the Guangxi Zhuang Autonomous Region,Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccine and New Technology,Guangxi,Nanning 530001,China

Objective To determine the content of gallic acid and total polyphenol in Radix Rhodomyrti.Methods Gal鄄lic acid in Radix Rhodomyrtiwas determined by ultra performance liquid chromatography(UPLC)with photo-diode-ar鄄ray(PDA)at215 nm,and themobile phasewasmethol-0.5%phosphateacid solustion(15颐85)ata flow rate of 0.2mL/min. The content of total polyphenolwas analyzed by spectrophotometry at 748 nm,gallic acid was selected as the reference substance.The colour-developing agentwas Folin-Ciocalteu忆s phenol reagent.Results The linear range for gallic acid and total polyphenol was 3.853-115.6滋g/mL(r=0.9999)and 1.0-7.0滋g/mL(r=0.9995)respectively.The recovery rate of gallic acid was 98.73%-100.76%and recovery rate of total polyphenol was 98.04%-101.17%.Conclusion The method is simple,rapid and good reproducible,can be used for quality control and quantitative analysis of Radix Rhodomyrti.

Radix Rhodomyrti;Gallic acid;Total polyphenol;UPLC;Spectrophotometry

R965

A[文献标识码]1673-7210（2015）06（c）-0096-04

院2015-03-20本文编辑院李亚聪)

广西畜禽疫苗新技术重点实验室系统性研究课题(13-051-27-A-6)。

银慧慧(1983.09-)袁女袁硕士袁从事药物分析研究。

孙建华(1959.10-)袁男袁研究员袁主要从事生物制药尧兽药及天然药物研究。