半夏泻心汤治疗糖尿病胃轻瘫的作用机制

张 燕，刘换新，邢德刚，张 宏，袁怀文

1 武警广东省总队医院病理科，广州 510507;2 广州医学院荔湾医院病理科，广州 510170;3广东药学院生理学教研室，广州 510006

糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis syndrome，DGP)由Kassander 于1958 年首次提出这个概念，DGP 的发病率大约有30%～50%，是糖尿病(DM)一个常见而重要的并发症［1］，它不但引起消化道症状导致营养不良和水电解质紊乱，还可削弱血糖的调控，改变口服药物

的吸收，促进糖尿病慢性并发症的发生和发展，严重影响患者的生活质量。本课题组前期实验研究表明半夏泻心汤无论对在体胃肠运动还是离体胃肠运动均具有双向性调节作用［2］。以往的临床应用表明，半夏泻心汤被广泛运用于治疗消化道运动障碍性疾病，尤其是在治疗胃肠功能性消化不良、糖尿病胃轻瘫方面疗效卓著。本实验采用免疫组化标记c-Kit 和Cx43 以及透射电镜观察ICC 的超微结构变化，观察半夏泻心汤对豚鼠胃平滑肌的影响，并探讨ICC 和Cx43 在半夏泻心汤治疗豚鼠糖尿病胃轻瘫的过程中所起的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年EWG/B 型豚鼠160 只(广东省医学实验动物中心提供)，体重250～300 g 之间，雌雄不限。

1.2 制备含药血清

实验用中药材购自广州市二天堂大药房，给药剂量依照人单位药方水煎剂的生药剂量比例按原著根据文献折算(半夏泻心汤组方由半夏55.78 g、黄芩、干姜、人参、炙甘草各46.875 g、黄连15.625 g、大枣42 g 组成，依照人单位体重生药量求得大鼠单位体重生药量，扩大10 倍)。于煎煮容器内，加相当于药材量5 倍的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，再加3 倍量水继续煎煮20 min，煎煮液浓缩后，制成浓缩液。按照剂量，每日分上、下午两次给药。第3d 全量给药后颈总动脉取血，立即注入无菌管中，室温静置，待血液凝固，血清析出后，吸取上清离心，再吸取上清即为含药血清。灭活30 min，用微孔滤膜过滤除菌，经培养实验证实无微生物污染后，置于-20 ℃保存备用。

1.3 建立糖尿病胃轻瘫模型

将豚鼠随机分为两组，糖尿病组120 只，正常对照组40 只。糖尿病组给予2%链脲佐菌素溶液80 mg/kg，腹腔注射，一周后测尿糖、血糖。尿糖(+++)以上，血糖浓度≥11.1 mmol/L，确定为糖尿病模型，不符合要求者予以剔除。正常对照组给予腹腔注射等量的生理盐水，血、尿糖正常。两月后通过记录色素胃排空和肠道传输速度，确定糖尿病胃轻瘫模型成功建立。

1.4 实验动物分组及给药方法

从糖尿病胃轻瘫模型组豚鼠中挑选出80 只，随机分成两组，半夏泻心汤治疗组40 只，模型组40只，另设空白对照组40 只。自糖尿病胃轻瘫模型造模成功后第8 d 起治疗组豚鼠每日2 次给予半夏泻心汤药液灌胃，每次给药1 mL/100 g 体重，连续服药14 d;空白对照组自由饮用水;模型组每日灌服生理盐水2 mg/100 g 体重，连续服用14 d。实验共重复三次。

1.5 实验方法

实验前动物禁食24 h，饮水不限。实验时猛击大鼠头部致昏，迅速取材其全胃标本，沿胃小弯剪开胃，切成2×1.5×0.3 cm3大小的组织块，10%福尔马林液固定，常规组织脱水、石蜡包埋、石蜡切片、HE 染色、中性树脂封片，光学显微镜下观察并比较对照组和实验组用药后胃平滑肌细胞的病理形态改变。

1.6 免疫组织化学检测胃窦组织中ICC 和Cx43 的数量和表达

采用免疫组织化学二步法测定。S-P 免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，试剂采用兔抗人c-Kit(Anti-Human CDll7)和Cx43 单克降抗休。取10%中性甲醛液固定后的胃窦组织，常规切取4 μm 厚度，脱蜡至水，经H2O2 阻断和抗原修复后严格按照试剂说明书进行操作。每批染色均设立阳性对照及阴性对照，用已知阳性组织切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作为阴性对照。光学显微镜下计数染色阳性细胞，每张切片随机各取6 个视野，通过HPIAS-2000 高清晰度彩色病理图像分析系统进行计算机读片和测量分析。

1.7 制作电镜标本并观察ICC 超微结构

将大鼠胃体组织剪切成1 mm3小块若干，置于2.5%戊二醛固定，0.1 mol/L 磷酸缓冲液(PBS)漂洗3 次，1%四氧化锇固定1 h。再用0.1 mol/L 的磷酸缓冲液PBS 漂洗3 次，乙醇、丙酮梯度脱水。环氧树脂(Epon)812 包埋，聚合37 ℃24 h，48 ℃24 h，60 ℃48 h。超薄切片机切片，厚约60～70 nm，200 目铜网捞片，酒精醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重电子染色，在日立H-600 型透射电镜下观察ICC 超微结构的变化:包括ICC 细胞之间、与其他细胞之间的连接结构、线粒体和细胞器的变化，染色质及肌膜的改变等。每例标本观察20 个以上铜网，并随机摄片。

1.8 数据处理

2 实验结果

2.1 一般情况

造模两月后，糖尿病组大鼠血糖明显升高，出现了明显多饮、多尿、多食，大便性状改变，大便干稀不等，精神倦怠，反应迟钝，体态瘦小，皮毛稀疏无光泽，皮肤溃疡明显高于对照组;糖尿病组大鼠的平均体重，明显低于正常对照组大鼠;糖尿病组大鼠的血糖，明显高于正常对照组;糖尿病组大鼠的胃排空率，显著延迟于正常对照组，由此确定糖尿病胃轻瘫模型建立成功。

表1 各组豚鼠体重、血糖和胃排空率变化(±s)Table 1 Changs of weight，blood glucose and gastric emptying rate in guinea pigs(±s)

表1 各组豚鼠体重、血糖和胃排空率变化(±s)Table 1 Changs of weight，blood glucose and gastric emptying rate in guinea pigs(±s)

2.2 胃ICC 和Cx43 的免疫组化表达情况

ICC 的阳性表达情况:1)正常对照组:c-Kit 阳性细胞呈棕黄色颗粒，着色鲜艳，定位于细胞膜和细胞质，密集地分布在胃体和胃窦部环形肌层和纵形肌层之间，主要集中于环形肌层内及附近，肌间神经丛之间和黏膜下内环肌层表面也有密集的ICC 分布，胃底肌间神经丛未见ICC 分布(图1A);2)糖尿病胃轻瘫模型组:c-Kit 阳性细胞分布密度和着色强度明显弱于对照组，非常稀疏地分布在环形、纵形肌层间，而且无环形肌层内及附近主要分布的特点(图1B);3)半夏泻心汤治疗组:阳性细胞同正常对照组一样主要分布在胃体和胃窦部环形肌层内及附近，数量较多(图1C)。Cx43 的阳性表达情况:Cx43以细胞膜和细胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性，正常对照组和半夏泻心汤治疗组Cx43 阳性表达密集分布在胃体和胃窦部环形肌层中，主要集中于环形肌层内及附近，阳性表达的强弱与ICC 的阳性分布具有一致性;糖尿病胃轻瘫模型组:Cx43 的数量明显比对照组少。

2.3 胃ICC 超微结构的变化

图1 正常对照组(A)、糖尿病胃轻瘫模型组(B)及半夏泻心汤治疗组(C)中豚鼠胃ICC 免疫组化的阳性表达分布情况Fig.1 Distribution of ICC’s positive express in guinea pigs of control group(A)，diabetic gastroparesis group(B)and Banxiaxiexin decoction group(C)

表2 各组豚鼠胃窦ICC、Cx43 数量的比较(±s，%)Table 2 Changes of ICC and Cx43’s numbers in guinea pigs(±s，%)

表2 各组豚鼠胃窦ICC、Cx43 数量的比较(±s，%)Table 2 Changes of ICC and Cx43’s numbers in guinea pigs(±s，%)

电镜观察结果显示:1)正常对照组:大鼠胃ICC主要分布于胃窦环形肌与纵形肌之间的肌问神经丛周围，由许多缝隙连接紧密地连接在一起，ICC 之间及其与平滑肌细胞、神经细胞之间多见由紧密并置的质膜形成的缝隙连接，细胞超微结构改变不明显，线粒体丰富(图2D)。2)糖尿病胃轻瘫模型组:胃窦ICC 与其它的ICC、平滑肌和神经末梢之问的缝隙连接均显著减少，尚存的细胞问连接的结构也有破坏，结构不清，连接松散且问隙增大;ICC 细胞内细胞器数量明显少于正常对照组;ICC 细胞的基膜结构不完整，缺乏连续性，有的基膜与细胞膜分离，形成空洞;ICC 细胞内的胞质广泛溶解，有大量的胞质内空泡形成，空泡大多沿质膜分布;线粒体肿胀、空泡样变、甚至溶解，内质网也有扩张(图2E)。3)半夏泻心汤治疗组:可见胃窦ICC 与平滑肌和神经末梢之间的缝隙连接均明显增多，有较发达的滑面内质网、线粒体和高尔基体，偶见基底膜不完整、线粒体轻度肿胀;胃ICC 的数量较胃轻瘫模型组增多，较正常对照组稍减少。ICC 形态结构基本正常，细胞表面突起增多，可见细胞连接，胞质内线粒体数量较胃轻瘫模型组增多，嵴清晰可见，粗面内质网排列整齐，数量较多，表面核糖体颗粒均匀。大鼠胃窦部lCC 的数量较模型组为多。胃ICC 之间、ICC 与平滑肌细胞及神经末梢间连接的病理损害较胃轻瘫模型组轻，其结构较清晰而紧密。壁内神经及Icc 的分布及突起连接的病理损害较胃轻瘫模型组为轻(图2F)。

图2 正常对照组(D)、糖尿病胃轻瘫模型组(E)及半夏泻心汤治疗组(F)中豚鼠胃ICC 的超微结构变化Fig.2 Changes of ICC ultrastructure in guinea pigs of control group(D)，diabetic gastroparesis group(E)and Banxiaxiexin decoction group(F)

3 讨论

糖尿病胃轻瘫(DGP)是近年来研究的一个热点，目前认为它是一个多因素疾病，其具体病理生理机制尚不十分清楚。因此，研究中药治疗糖DGP 的作用机制能为胃动力障碍疾病的防治提供理论依据，具有重要临床意义。消化道通过胃肠道平滑肌细胞的舒缩运动来完成对食物的机械性消化，并推动食物的前进。平滑肌细胞是胃肠道运动的基本结构和功能单位，在80 年代末，Bitar 和Makhfou 首先建立了测量豚鼠分离胃平滑肌细胞技术，许文燮等将其技术做出相应调整，成功制备了豚鼠游离单个胃平滑肌细胞，并应用于实验研究［3］。胃肠道Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是一类具有独特功能的间质细胞，由西班牙神经解剖学家Cajal于1893 年首次发现，这些细胞呈网状分布在胃肠道神经末梢与平滑肌细胞之间，对控制胃肠动力功能起关键作用。ICC 是胃肠慢波的起搏细胞，主要参与胃肠基本电节律(BER)调控和神经递质信号转导，近年来进行的一系列研究表明这种细胞在胃肠电及动力发生和运动障碍机制中有重要作用［4］，研究证实ICC 数量减少或网络结构破坏可造成胃慢波消失或节律失常，胃排空延迟［5］。Jameson 等发现糖尿病患者胃活体组织切片显示ICC 明显减少，甚至缺失。ICC 表达原癌基因c-kit，c-Kit 表达一种受体酪氨酸激酶CD117/c-Kit 蛋白，它是干细胞因子(stem cell facter，SCF)受体，可被特异性的抗体检测出来［6，7］。应用针对c-kit 的免疫组化标记抗体可以特异性识别ICC［8］，在显微镜下观察ICC 的分布和密度。

ICC 网络与平滑肌细胞间通过缝隙连接(gap junctions)相连，是其发挥生理功能的重要结构基础，Connexin43(Cx43)是最重要的缝隙连接蛋白。实验证明糖尿病胃轻瘫大鼠胃壁内ICC 明显减少，Cx43 表达也明显减低。张亚萍等用透射电镜发现糖尿病大鼠ICC 与其他细胞间的连接结构显著破坏，线粒体肿胀，空泡样变，细胞器数量减少，异染色质明显，肌膜分离形成空洞，ICC 超微结构的改变造成其功能改变，这可能是糖尿病胃肠功能紊乱的病因之一。

现代医学对胃肠动力障碍性疾病的机理研究较深入，但在治疗上却进展不大，西药促动力药由于明显的副作用及疗效的不确定，限制了其临床应用。而中医药治疗胃肠动力疾病具有明显的优势，由于疗效确切、副作用小及临床应用广泛，故运用中药治疗胃动力障碍疾病正越来越受到人们亲睐。祖国医学非常重视脾胃(包括现代医学的胃肠)的功能，在长期的临床实践中积累了丰富的治疗经验。近年来人们对中药对胃动力的影响及其调节机制做了进一步的研究，并提出了“胃动力中药”这一概念，从中医中药中寻找治疗胃动力障碍的有效药物，有着重要意义。半夏泻心汤出自东汉著名医学家张仲景所撰的《伤寒论》，全方由半夏、干姜、黄芬、黄连、人参、大枣、甘草七味药组成，具有辛开苦降、寒温并用、攻补兼施的功能，为调节胃肠运动障碍之良方。以往大量临床和基础研究表明半夏泻心汤具有明显的调节胃肠运动作用，而长期的临床治疗经验也表明半夏泻心汤对呕吐、腹泻、消化不良等消化系统疾病具有明显疗效，但以往的研究大多停留在系统与器官水平，很少利用现代化研究方法对半夏泻心汤的作用机制进行研究，由于缺乏细胞与分子水平的研究，不能从根本上阐明其药理学作用机制。

为了深入研究半夏泻心汤的作用机制，明确其药理作用靶点，本课题实验通过采用免疫组化标记c-kit 和Cx43，透射电镜观察ICC 的超微结构等多种分子病理学技术方法，观察并比较半夏泻心汤含药血清治疗前后糖尿病胃轻瘫动物模型胃平滑肌细胞、ICC 和Cx43 的变化，从而探讨其治疗作用及机制。实验结果表明半夏泻心汤含药血清能明显增加实验豚鼠ICC 的数量并修复其受损结构，进而增强实验豚鼠的胃动力并恢复其功能，从而起到治疗实验豚鼠糖尿病胃轻瘫的作用。这不仅从细胞和分子水平初步阐明了半夏泻心汤治疗实验豚鼠糠尿病胃轻瘫的作用机制，也为临床防治胃肠运动障碍性疾病提供了重要的理论依据，由此成为中药现代化研究一个新的突破口。

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