杜仲叶黄酮苷元水解及富集纯化工艺研究

王志宏，彭 胜，雷明盛，2，3，郑 阳，史丽娟，周云雷，彭密军

1 吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室 杜仲湖南省工程实验室，张家界 427000;2武汉大学中南医院，武汉 430071;3 湖南省张家界市人民医院，张家界 427000

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)是杜仲科杜仲属植物，因其具有“三降六抗一增”功效而成为我国特有的名贵滋补药材［1］。它富含多种活性成分，如黄酮类、木脂素类、苯丙素类和环烯醚萜类等。其中黄酮类物质有明显的保护心血管、抗氧化、清除自由基、增强免疫以及抗肿瘤等功效［2］。我国杜仲种植范围广泛，杜仲叶资源丰富易得，且杜仲叶中总黄酮含量较高。研究表明，杜仲叶富含多种黄酮:槲皮素、山奈酚、山奈酚-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖基-(1→2)-阿拉伯糖苷或槲皮素-3-O-木糖基-(1→2)-葡萄糖苷等［6，7］。但在消化、吸收和代谢过程中，黄酮苷元比黄酮苷的效价高［3-5］。赵德义［8］等人通过比较杜仲黄酮和银杏黄酮的HPLC 指纹图谱发现，杜仲黄酮苷元主要为槲皮素和山奈酚。酸水解可将糖苷水解为对应的苷元，而聚酰胺树脂对含酚羟基化合物的富集纯化效果较好，为富集总黄酮的理想材料，采用聚酰胺树脂富集杜仲总黄酮的条件较为成熟［9］，但是对杜仲黄酮苷元的富集工艺却很少见报道。本研究参考《中国药典》中银杏黄酮的水解工艺，对杜仲黄酮的水解工艺进行考察［10］，进而考察苷元的富集工艺，以期为杜仲叶资源优势向经济优势转化寻找有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

杜仲叶于2013 年11 月份采集于吉首大学张家界校区，经廖博儒研究员鉴定为杜仲;将采集的矮林杜仲叶，经微波杀青，50 ℃烘干，粉碎，过80 目筛，备用;槲皮素(Quercetin，批号YA0806YB13，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，HPLC);山奈酚(Kaempferol，批号20130329，上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，HPLC);甲醇为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司);聚酰胺树脂(60～100目)、盐酸、氢氧化钠、醋酸、95%乙醇等均为分析纯。

1.2 仪器和设备

LC-20A 高效液相色谱仪，日本岛津;U-3900 紫外分光光度计，日本HITCHI 公司;BM400 型数显电热恒温水浴锅，日本YAMATO;AEL-405M 型万分之一天平，日本SHIMADZU;GZX-9146-MBE 数显鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 杜仲黄酮苷元HPLC 检测条件

高效液相色谱条件:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;流动相:甲醇-0.2%磷酸(63∶37);检测波长:370 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;进样量20 μL［11］。

1.3.2 杜仲黄酮苷元TLC 检测条件

薄层色谱检测条件:展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶1)，显色剂为1%三氯化铝-乙醇溶液，显色、晾干后置于紫外灯365 nm 下检测［12］。

1.3.3 杜仲叶提取物样品制备方法

取适量杜仲叶样品，加入95%乙醇，超声辅助提取60 min，过滤，滤液保存备用;滤渣再用60%乙醇以1∶20(g/mL)料液比超声辅助提取60 min，过滤;合并两次滤液，减压浓缩、冷冻干燥，得杜仲叶提取物［13］。

1.3.4 水解杜仲黄酮单因素与正交试验

实验以黄酮苷元槲皮素和山奈酚总和为考察指标。准确称取20 mg 杜仲叶提取物，经参考相关文献及在预实验的基础上［14，15］，确定单因素考察如下:料液比(mg/mL)为4∶1、3.5∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1 和1∶1，水解时间考察范围为2、3、4、5、6 h，水解温度考查范围为50、60、70、80、90 ℃，盐酸浓度为3、4、5、6、7、8 mol/L。依据单因素实验结果，选择L9(34)的正交实验表进行设计，确定水解杜仲黄酮制备黄酮苷元的最佳工艺，试验重复3 次。

1.3.5 黄酮苷元的富集工艺

在最佳工艺条件下制备适量的杜仲叶黄酮苷元样品，减压浓缩后水洗至中性;用甲醇洗涤滤饼，收集滤液，薄层色谱检测至无目标物止。将滤液与适量聚酰胺树脂混合，进行充分的静态吸附，混合装柱，再经梯度洗脱，薄层色谱跟踪检测，收集相同洗脱液，合并、减压浓缩、冷冻干燥得粗样品，HPLC 法测其含量;然后将所得粗产品通过干法上样进行聚酰胺二次富集，HPLC 跟踪检测，收集相同洗脱液，合并、减压浓缩、冷冻干燥得纯化样品，测定样品中黄酮苷元含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对水解的影响

在70 ℃条件下，以甲醇∶盐酸为4∶1，盐酸浓度为6 mol/L，将料液比(mg/mL)设为4∶1、3.5∶1、3∶1、2.5∶1、2∶1、1.5∶1 和1∶1，水解4 h，结果见图1(A)。随料液比比例增加，水解所得黄酮苷元的含量呈增加趋势，但当料液比达到2∶1 之后，苷元含量基本趋于平稳。原因可能是料液比较大时，水解反应及物质的溶解在体系中不充分;当溶剂比例提高到一定程度，即料液比较小时，虽然反应较为彻底，但体系中酸含量的增大又会对苷元造成影响，并从节约实验成本角度出发，所以将实验料液比选为2∶1(mg/mL)。

2.1.2 水解温度对水解的影响

以料液比为2∶1(mg/mL)，甲醇∶盐酸为4∶1，盐酸浓度为6 mol/L，温度为50、60、70、80、90 ℃，水解4 h，考察不同水解温度对水解黄酮苷元含量的影响，结果见图1(B)。由图可知，随温度的升高，分子运动加快，有利于水解反应的进行，但是温度过高，副反应增加，杂质相应增多。综合考虑，确定水解温度为70 ℃左右。

2.1.3 水解时间对水解的影响

按照水解条件，以料液比为2∶1(mg/mL)，甲醇∶盐酸为4∶1，盐酸浓度为6 mol/L，水解温度为70℃，水解时间分别为2、3、4、5、6 h，进行水解，考察不同水解时间对水解得黄酮苷元含量的影响，结果见图1(C)。由图可得，水解4 h 时，苷元的含量达到最大值，当水解反应时间较短时，水解不充分;水解时间过长时，在体系中会产生副产物从而影响苷元的含量。综合考虑，确定水解时间为4 h 左右。

2.1.4 盐酸浓度对水解的影响

在70 ℃下，料液比为2∶1(mg/mL)，盐酸浓度分别为3、4、5、6、7、8 mol/L，甲醇∶盐酸为4∶1，水解4 h，考察不同盐酸浓度对水解得黄酮苷元含量的影响，结果见图1(D)。由图可得，随盐酸浓度的增加，苷元含量呈现先增后减的趋势，原因可能为酸虽然可以使糖苷键质子化，但是酸的浓度过高，可能会对黄酮的母核造成破坏，降低黄酮苷元的含量。综合考虑，确定水解盐酸浓度为6 mol/L 左右。

2.2 正交试验结果

根据单因素实验结果，以水解温度、水解时间和盐酸浓度3 个指标作为正交实验考察的优化水平，每个因素选取3 个因素水平，进行L9(34)正交实验，因素水平表见表1，正交实验结果见表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiments

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiments

根据正交实验的结果，极差分析发现，对杜仲黄酮水解工艺的影响较大的因素依次为盐酸浓度、水解时间和水解温度。方差分析结果见表3，由方差分析可得，水解温度和水解时间对实验结果的影响达到显著，而盐酸浓度对黄酮苷元含量的影响达到极显著。综合考虑，确定最佳的水解工艺为A3B1C2，即水解温度为80 ℃，水解时间为3 h，盐酸浓度为6 mol/L。

表3 方差分析表Table 3 Table of variance analysis

按照正交试验结果，在料液比为2∶1(mg/mL)条件下，将A3B1C2的工艺重复3 次，对该工艺的稳定性进行验证，苷元的含量为2.512%(RSD=0.059%)，表明该工艺的重现性与稳定性较好，达到优化目的。

杜仲叶中黄酮苷元主要为槲皮素和山奈酚，但是其游离存在的含量很低，经测定槲皮素的含量为0.021%，而山奈酚为0.005%，本实验通过酸水解杜仲黄酮使水解物中的苷元含量达到2.512%，提高近100 倍。

2.3 杜仲黄酮苷元富集工艺的研究

采用不同梯度的甲醇-水体系以2 BV/h 的流速进行洗脱，最后用100%甲醇洗至检测不到苷元为止。洗脱液用薄层色谱跟踪检测，结果见表4。50%甲醇洗脱液中已经含有苷元，含量极低，70%～100%洗脱液中苷元含量较高，合并洗脱液，浓缩，冷冻干燥，得黄酮苷元粗品。HPLC 法测其纯度为12.87%。

表4 薄层检测洗脱液中苷元的结果Table 4 Enriching result of flavonoid aglycone in the eluent with TLC

将上述所得样品干法上样，进行聚酰胺二次富集。洗脱流速为2 BV/h，每梯度洗脱体积为5 BV，经水与低浓度的醇溶液除杂之后，用70%、90%和100%甲醇溶液洗脱，每50 mL 收集一次。实验发现，50%甲醇洗脱液中并未检测到杜仲黄酮苷元，黄酮苷元主要存在70%～100%洗脱液中，洗脱曲线如图2 所示，合并成分相似的洗脱液，减压浓缩，得杜仲黄酮苷元样品。经HPLC 法测定，黄酮苷元纯度达63.19%，黄酮苷元纯度较一步富集提升将近5 倍。

图2 黄酮苷元的洗脱曲线Fig.2 The elution curve of flavonoid aglycone

3 结论

杜仲黄酮苷元可由酸水解制备所得，在料液比为2∶1(mg/mL)，水解温度80 ℃，水解时间3 h，盐酸浓度6 mol/L 的最佳工艺参数条件下，黄酮苷元最高含量可达2.512%;对水解液减压浓缩、脱酸处理，经聚酰胺一步富集，黄酮苷元含量为12.87%，所得样品再干法上样，经聚酰胺两步富集之后，杜仲黄酮苷元含量可达63.19%。

1 Li FD(李芳东)，Du HY(杜红岩).Eucommia ulmoides Oliv.(杜仲).Beijing:China Press of Traditional Chinese Medicine，2001.1-2.

2 Wang ZH(王志宏)，Peng S(彭胜)，Lei MS(雷明盛)，et al.Advances in studies on biological activity of Eucommia ulmoides Oliv.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2013，25:1302-1309.

3 Izumi T，Piskula，Osawas，et al.Soy isoflavone aglycones are absorbed faster and in higher amounts than their glucosides in humans.J Nutri Edu，2000，137:1695-1699.

4 Lv P(吕鹏)，Huang XW(黄晓舞)，Lv QJ(吕秋军).Advances in studies on absorption，distribution，metabolism，of flavonoids.China J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2007，32:1961-1964.

5 Crepy V，Morand C，Besson C，et al.Quercetin，butnot its glycolsides，is absorption from the rat stomach.J Agric Food Chem，2002，50:618-621.

6 Cheng J(成军)，Zhao YY(赵玉英)，Cui YX(崔玉新)，et al.Study on flavonoids from leave of Eucommia ulmoides Oliv.China J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2000，25:284-286.

7 Fu GM(付桂明)，Wan Y(万茵)，Zhang S(张硕)，et al.Supercritical fluid extraction technology of flavonoids in Eucommia ulmoides Oliv.leaves and components analysis by LC-MS.Food Sci(食品科学)，2007，28:128-131.

8 Zhao DY(赵德义)，Gao JM(高锦明)，Xu AX(许爱遐)，et al.Study on fingerprint analysis and bioactive function of Eucommia ulmoides flavonoids.Acta Bot Boreal Occident Sin(西北植物学报)，2003，23:1988-1990.

9 Lin CM(林春梅).Separation and purification of total flavones in burdock leaves by polyamide column.Food Ferment Ind(食品发酵与工业)，2014，20:236-238.

10 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol I，296.

11 Wang ZH(王志宏)，Zhou YL(周云雷)，Peng S(彭胜)，et al.Simultaneous determination of flavonoid aglycones from Eucommia ulmoides Oliv.by HPLC.Appl Chem Ind(应用化工)，2014，43:950-953.

12 Li CH(李春红)，Pan H(潘红)，He B(何兵)，et al.TLC identification of quercetin and kaempferol and determination of total flavonoids in Toona sinensis leaves.J Luzhou Med Coll(泸州医学学报)，2010，33:247-249.

13 Lv Q(吕强)，Peng MJ(彭密军)，Peng S(彭胜)，et al.Effect of different planting modes on contents of active ingredients in leaves，twig and bark in Eucommia ulmoides.Econ Forest Res(经济林研究)，2012，30:73-76.

14 Wu Y(伍毅).Study on preparation of flavone aglycone from Ginkgo biloba L.extract.Wuxi:Jiangnan University(江南大学)，MSc.2008.

15 Li FG，Zhou H，Sun DL，et al.An efficient method for the simultaneous determination of three flayone aglycones in FlosChrysanthemi by acid hydrolysis and HPLC.J Chin Pharm Sci，2009，18:55-59.