耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌分子流行病学研究

张风华 李小燕 王宝枝 张晓英

1.广州医科大学附属第四医院普外科，广东广州511447；2.广州医科大学附属第四医院检验科，广东广州511447

耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌分子流行病学研究

张风华1李小燕2▲王宝枝1张晓英1

1.广州医科大学附属第四医院普外科，广东广州511447；2.广州医科大学附属第四医院检验科，广东广州511447

目的探讨院内普通外科分离的铜绿假单胞菌的基因同源性及Ⅲ型分泌系统（TTSS）的毒力基因的临床意义。方法采用纸片扩散法（KB法）及微量肉汤稀释法检测2009年12月～2014年9月广州医科大学附属第四医院普通外科临床分离的102株铜绿假单胞菌对常用的13种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌进行基因分型及毒力基因筛查，同时采用PCR调查毒力基因exo U、exo S在耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌中的发生率。结果102株铜绿假单胞菌对临床常用的13种抗菌药物耐药率均低于30%，对阿米卡星的耐药率最低（9.8%），对亚胺培南的耐药率为23.5%，对美罗培南的耐药率为18.6%。24株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌PCR检测显示均携带TTSS，其中3株exo U+/exo S-，21株exo U-/exo S+；PFGE分型主要为A、B、C、D、E、F共6型，其中A型为主要流行株。回顾性分析表明，exo U+/exo S-型患者临床特征是多有气管插管史、ICU住院史、抗感染治疗多采用联合用药，以铜绿假单胞菌感染居多；exo U-/exo S+患者的临床特征是多存在肺部基础疾病，预后好于exo U+/exo S-型患者，以铜绿假单胞菌定植居多。结论耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌在普通外科存在流行趋势，应加强铜绿假单胞菌耐药监测，防止耐药菌的暴发流行。

铜绿假单胞菌；耐碳青霉烯；脉冲场凝胶电泳

铜绿假单胞菌是临床常见的非发酵条件致病菌之一，在院内容易引起传播，尤其在设备及器械上均可分离到本菌，可通过各种途径传播给患者。碳青霉烯类药物被认为是治疗铜绿假单胞菌最有效的药物之一[1]。但是随着该类药物的广泛应用，细菌对其耐药性也逐渐上升[2]，严重影响其临床应用。近几年来，世界各地均已发现多重耐药铜绿假单胞菌，并报道了有相关的暴发和流行趋势，发现其耐药率正逐年上升[3]。判断耐药细菌的同源性，可以对其进行分子分型分析判断是否存在有克隆播散，而分子分型对于控制院内感染播散以及指导临床用药治疗具有非常重要的作用和意义。为了解院内普通外科铜绿假单胞菌的基因同源性并且探讨铜绿假单胞菌在普通外科是否存在流行趋势，本研究收集102株铜绿假单胞菌临床分离株，采用13种临床上经常使用的抗生素进行体外药敏实验，同时还采用脉冲场凝胶电泳（puised—fieid geiele etrophoresis，PFGE）对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌临床分离株进行基因分型。此外，有研究表明，Ⅲ型分泌系统（TTSS）是铜绿假单胞菌重要的致病机制[3]，TTSS阳性铜绿假单胞菌常以exo U+/exo S-、exo U-/exo S+、exo U+/exo S+、exo U-/exo S-4种形式存在。因此，本研究还对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌临床分离株进行调查，比较exo U、exo S基因阳性菌株的分子流行病学特征和治疗转归，以期为下一步开发针对铜绿假单胞菌致病毒素的非抗菌药物治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源收集2009年12月～2014年9月广州医科大学附属第四医院（以下简称“我院”）普通外科临床分离铜绿假单胞菌共102株，所有菌株均经鉴定证实，采用法国生物梅里埃公司所生产的VITEK2 Compact全自动微生物鉴定分析系统为鉴定系统。采用的质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922。

1.1.2 主要试剂中国药检所生产的哌拉西林、氨曲南、阿米卡星、头孢吡肟、环丙沙星、头孢西丁、头孢他啶、头孢噻肟和他唑巴坦等抗生素粉针剂；华山抗生素研究所提供的参考菌株沙门菌Braenderup血清型H9812。大连TaKaRa公司所生产的SpeI限制性内切酶和蛋白酶K；PFGE使用胶为美国美国应用生物系统公司生产的Gold Agarose琼脂糖胶。

1.1.3 主要仪器法国生物梅里埃股份有限公司生产的VITEK2 Compact全自动微生物鉴定分析系统；美国Bio-RAD公司生产的紫外线投射凝胶成像系统和Bio-RAD CHEF MapperTM脉冲场凝胶电泳仪。

1.2 方法

1.2.1 采用微量肉汤稀释法检测抗生素的药物敏感性试验按照2013年美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）公布的标准，102株铜绿假单胞菌对13种抗生素的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）根据上述的标准进行检测[4]。

1.2.2 PFGE肉汤摇菌培养过夜，取1 mL菌液离心后用双蒸水混匀并加入低熔点琼脂胶进行包埋，在含有20 μL蛋白酶K的细胞裂解液中54℃水浴摇床2 h。切胶后用限制性内切酶SpeI 37℃酶切4 h。加热溶解l%Gold Agarose琼脂糖胶后冷却至55℃（琼脂糖胶由0.5×TBE缓冲液配制而成），倒入模具后静置30 min成型。电泳条件设置：脉冲时间6.75～35.38 s，6 V/cm，相对分子质量30 000～600 000，14℃，电场角度120°，总时间为20 h。结果观察：电泳结束后用0.25 mg/L的溴化乙锭（EB）染色30 min，后蒸馏水冲洗15 min，在凝胶成像仪下观察电泳结果。相对分子质量标准（Marker）采用全球统一参考菌株沙门菌Braenderup血清型H9812。PFGE按美国疾病控制和预防中心（Centers for Disease Contrl and Prevention，CDC）推荐的方法判读结果，差异3个条带以上者为另一型，酶切后图谱完全一致定为同一型，有1～3个条带不同者为同一型的不同亚型。

1.2.3 PCR检测TTSS系统参照文献[5-7]，设计PCR引物（表1），采用25 μL的PCR反应体系，其中包含了2倍PCR混合溶液（含有脱氧和磷酸PCR缓冲体系，广州东盛生物科技公司生产）12.5 μL、H2O为9.5 μL、P1引物为1 μL、P2引物为1 μL、DNA模板1 μL。设定的反应条件为：94℃预变性4 min，然后94℃30 s、62℃30 s、72℃60 s，循环35次，最后在72℃时延伸7 min。所扩增得产物经l0 g/L琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭（0.5 μg/mL）染色15 min后，在实验室的成像仪下密切观察并摄像记录其详细的结果。所得到的PCR产物由深圳东盛生物科技公司完成测序，将所得到的序列检测结果在GenBank数据库中彩用BLAST程序进行相关分析，进行菌株的毒力基因类型的判定。

表1 铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统以及检测引物

2 结果

2.1 药敏结果分析

普通外科收集的102株铜绿假单胞菌对13种抗生素普遍耐药，对阿米卡星的耐药率最低（9.8%），其次是对妥布霉素的耐药率（10.8%）；对氨曲南和亚胺培南的耐药率最高，分别为24.5%和23.5%。在耐碳青霉烯类组，24株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌，除了对亚胺培南和美罗培南的耐药率最高之外，对头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均高于50%。见表2。

表2 铜绿假单胞和耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌对抗菌药物的敏感率、耐药率（%）

2.2 基因同源性分析

对24株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌经SpeI限制性内切酶酶切后进行脉冲场凝胶电泳实验，图像应用PFGE分析软件Bionumerics 6.0处理分析，结果发现有6个克隆株。其中A型（包括亚型Al、A2）16株，B型2株，C型2株，D型2株，E型1株，F型1株。见图1。

图1 PFGE软件分析

2.3 PCR检测TTSS系统结果

24株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌PCR检测显示均携带TTSS，其中3株exo U+/exo S-，21株exo U-/exo S+。回顾性分析表明，exo U+/exo S-型患者临床特征是多有气管插管史、ICU住院史、抗感染治疗多采用联合用药，以铜绿假单胞菌感染居多；exo U-/exo S+的临床特征是多存在肺部基础疾病，预后好于前者，以铜绿假单胞菌定植居多。

3 讨论

铜绿假单胞菌是条件致病菌中的一种，一般为医院内获得性感染，很容易导致医院感染的暴发和流行。近年来，世界各地都收集到对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌，并且暴发流行[8]。

在TTSS毒力蛋白组中，ExoS和ExoU的临床意义尤为重要。exo U+表达蛋白ExoU可导致细胞的凋亡和坏死，因此称其为细胞毒型基因，其所造成的危害是非常大的；exo S+表达蛋白ExoS被称为细胞侵袭型基因，能抑制细胞的分裂并促进细胞的凋亡等，这可能与其具有腺苷二磷酸核糖转移酶活性有关[9]。exoU+铜绿假单胞菌感染后的症状与exo S+比较更为严重，所致患者的病死率更高[10]。随着exo S、exoU毒力基因的产生，给临床抗菌治疗带来极大困难。

铜绿假单胞菌常以exo U-/exo S+（侵袭型）和exo U+/exo S-（细胞毒型）形式存在。既往研究显示，TTSS和患者较差的临床预后密切相关，而对于携带不同类型TTSS菌株患者的临床特征鲜有报道[11-13]。本次研究中，结合了患者临床特征以及exo U和exo S毒力表型的分析，为区分我院普通外科住院患者中铜绿假单胞菌定植或是感染提供了可靠依据：检测到exo U基因为阳性的患者，其铜绿假单胞茵的毒力强，容易导致全身感染，并且患者的病死率较其它的高，故临床上应积极地早期选择有效的抗生素进行治疗；检测到exo S基因为阳性的，因为铜绿假单胞菌有定植于患者皮肤以及呼吸道的倾向，应密切观察病情变化、根据病情变化调整抗生素的使用，避免抗生素使用过度[14-16]。

PFGE技术具有非常好的重复性和分辨率，是研究细菌基因分型中的“金标准”[17]，因此运用此方法对24株多重耐药铜绿假单胞菌进行同源性分析，比对结果发现大多来源于同一个克隆株，而该24株菌均分离于不同患者的不同标本，其中有16株属于同一菌株（主流型），时间跨度2011～2014年，提示患者之间存在交叉感染；同时，同一克隆型细菌之间，耐药性有差异，这可能与不同患者使用不同抗菌药物有关。因此，医院存在耐药克隆株的传播流行时，应该采取有效措施控制铜绿假单胞菌的传播；密切监测耐药株的变迁和发展趋势，是防止和延缓铜绿假单胞菌耐药和暴发流行的必要措施。

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Study of the resistance mechanisms to carbapenems and molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa

ZHANG Fenghua1LI Xiaoyan2▲WANG Baozhi1ZHANG Xiaoying1
1.Department of General Surgery,the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province, Guangzhou511447,China;2.Department of Clinical Lab,the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou511447,China

Objective To investigate the general surgery of Pseudomonas aeruginosa nosocomial gene homology and typeⅢsecretion system(TTSS)virulence genes of clinical significance.Methods 102 strains of pseudomonas aeruginosa isolated from December 2009 to September 2014 in Department of General Surgery,the Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,the minimal inhibitory concentration of those Pseudomonas aeruginosa to 13 kinds of commonly used antibiotics were detected by the method of disc diffusion and trace the broth dilution.Genotyping and virulence gene screening of Penicillium carbon alkene resistant Pseudomonas aeruginosa were carried by pulsed field gel electrophoresis(PFGE)technology,at the same time incidence rate of virulence genes exo U and exo S in carbapenem resistant Pseudomonas aeruginosa was investigated by PCR.Results 102 strains of Pseudomonas aeruginosa to clinical commonly used 13 kinds of antimicrobial resistance were less than 30%,the lowest prevalence of Amikacin resistance(9.8%),resistant rate to Imipenem were 23.5%,resistant rate to Meropenem were 18.6%.24 strains Penicillium resistant to carbon alkene detect Pseudomonas aeruginosa PCR showed all carry TTSS,three strains exo U+/exo S-,21 strains exo U-/exo S+;types of PFGE were A,B,C,D,E,F,a total of 6 types,and type A was the main epidemic strains.Retrospective analysis showed that,clinical characteristics of patients with exo U+/exo S-type was more histories of endotracheal intubation and ICU admission,anti-infection treatment with combination,in the majority with Pseudomonas aeruginosa infection.clinical features of patients with exo U-/exo S+was many patients existed pulmonary diseases,the prognosis of patients with exo U-/exo S+was better than that of patients with exo U+/exo S-,in the majority with Pseudomonas aeruginosa engraftment.Conclusion Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in general surgery are popular trend,Pseudomonas aeruginosa resistance monitoring should be strengthened,to prevent the epidemic of drug-resistant bacteria.

Pseudomonas aeruginosa;Resistance to carbapenems;Pulsed field gel electrophoresis

R632

A

1673-7210（2015）06（b）-0101-04

2015-01-26本文编辑：任念）

广东省医学科研基金立项课题项目（B2014200）；广东省广州市教育局青年项目（10A271）。

张风华（1975.11-），男，硕士研究生；研究方向：肝胆胰脾外科。

▲通讯作者