人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和人端粒酶RNA基因联合检测在宫颈癌筛查中的意义

王 娟 李 燕 赵骏达 马俊旗

新疆医科大学第一附属医院妇科生殖助孕中心妇科门诊，新疆乌鲁木齐830000

人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和人端粒酶RNA基因联合检测在宫颈癌筛查中的意义

王 娟 李 燕 赵骏达 马俊旗▲

新疆医科大学第一附属医院妇科生殖助孕中心妇科门诊，新疆乌鲁木齐830000

目的探讨人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和人端粒酶RNA基因联合检测在宫颈癌筛查中的意义。方法选取2012年10月～2014年10月新疆医科大学第一附属医院行宫颈癌筛查的患者627例，先行液基细胞学检查，后行阴道镜检查并取活检，同时行人乳头状瘤病毒L1壳蛋白检测和人端粒酶RNA基因检测。分析不同病症间临床指标的变异情况。结果未见上皮病变或恶性改变（NILM）、意义不明的不典型鳞状细胞与不典型腺细胞（ASC-US）、不除外高度鳞状上皮内病变的的不典型鳞状细胞（ASC-H）、低度鳞状上皮内病变（LSIL）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）、鳞状细胞癌（SCC）、腺癌（AC），人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性表达率分别为18.6%、42.9%、51.0%、80.6%、47.4%、5.9%、0.0%，差异有高度统计学意义（χ2=93.770，P＜0.01），呈先升高后降低趋势，在LSIL达到最高点，在AC降至最低点；人端粒酶RNA基因阳性表达率分别为0.0%、19.9%、36.3%、51.6%、94.7%、100.0%、100.0%，差异有高度统计学意义（χ2=279.564，P＜0.01），呈持续升高趋势，在SCC与AC达到最高点。依正常、炎症、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宫颈癌顺序，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性表达率分别为18.6%、46.1%、80.6%、53.3%、25.0%、3.6%，差异有高度统计学意义（χ2=93.015，P＜0.01），呈先升高后降低趋势，在CINⅠ期达到最高点，在宫颈癌降至最低点；人端粒酶RNA基因阳性表达率分别为0.0%、26.4%、51.6%、93.3%、100.0%、100.0%，差异有高度统计学意义（χ2=269.582，P＜0.01），呈持续升高趋势，在CINⅢ期达到最高点。结论人乳头状瘤病毒L1壳蛋白联合人端粒酶RNA基因检测，在宫颈癌前病变中具有较高的指导价值。

人乳头状瘤病毒L1壳蛋白；人端粒酶RNA基因；宫颈癌

宫颈癌是临床常见病症，也是女性特有疾病之一，在恶性肿瘤疾病中，其发病率仅次于乳腺癌[1]，每年我国的新发病例和病死病例约为13.5万人和5.0万人[2]，且近年来，其发病率持续上升，严重影响着妇女的身体健康，也明显影响患者的预后状况。因而及早诊断和治疗是改善患者的预后，提高患者生活质量的有效手段。目前，临床筛查宫颈癌的临床指标有多种，其中人乳头状瘤病毒L1壳蛋白是评价人乳头状瘤病毒感染状态的有效指标[3-4]。在宫颈细胞由非典型性病变向宫颈癌转变过程中，几乎都伴有3号染色体长臂扩增，且常见片段位于3q26～27，且定位于3q26.3的人端粒酶基因中，因而检测人端粒酶RNA基因有助于筛查宫颈癌[5-6]。为探讨人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和人端粒酶RNA基因联合检测在宫颈癌筛查中的意义，本研究选取新疆医科大学第一附属医院（以下简称“我院”）行宫颈癌筛查的患者627例，先行液基细胞学检查，后行阴道镜检查并取活检。同时行人乳头状瘤病毒L1壳蛋白检测和人端粒酶RNA基因检测。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年10月～2014年10月于我院行宫颈癌筛查的女性患者627例，排除患有其他器质性疾病、血液性疾病、免疫性疾病、精神疾病的患者。宫颈癌的诊断标准符合2011年《中华人民共和国卫生行业标准（WS 334-2011）》，后经病理组织学检查确诊。年龄21～63岁，平均（35.6±10.7）岁；体重37～74 kg，平均（43.8±11.5）kg；其中未婚妇女134例，已婚妇女493例；未妊娠妇女102例，妊娠妇女391例；妊娠妇女中，初产妇276例，经产妇115例。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者和/或家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

所有患者先行液基细胞学检查，后行阴道镜检查并取活检。

1.2.1 液基细胞学检查用特制的长柄毛刷在宫颈鳞柱交界的部位行顺时针旋转5圈，然后将刷头置入配套保存瓶（内含固定液）中，使用超柏氏薄层细胞检测系统对标本实施批量预处理，制片并染色，使用美国Cytye公司生产的Thinprep 2000液基模式薄层扫描仪进行细胞学检测。

1.2.2 阴道镜检查并取活检所用仪器为美国威龙公司生产的8900型伟花电子阴道镜，在非月经期窥器暴露宫颈，将宫颈表面分泌物拭净，用浸透3%～5%冰乙酸的棉球浸润宫颈30～60 s，在镜下观察转化去的改变情况，包括颜色、血管、形态，同时观察鳞状上皮和柱状上皮交界处，寻找异常阴道镜图像，在可疑部位取组织行活检，这些部位包括白色上皮、点状血管、镶嵌、腺口周围白环、异性血管、明显突起的部位，未见可疑病变时，可在转化区3、6、9、12点和宫颈管做活检，将活检组织放入10%福尔马林液中固定，行石蜡包埋、切片、HE染色，由专业的阅片人员进行检测。

1.2.3 人乳头状瘤病毒L1壳蛋白检测人乳头状瘤病毒L1壳蛋白检测试剂盒购自于美国Advanced医疗科技有限公司，采用DNA核酸杂交与免疫组织双重检测，包括6、11、16、18、31、45型等在内的28型人乳头状瘤病毒L1壳蛋白，严格按照说明书进行操作。人端粒酶RNA基因联合检测试剂盒购自于北京金菩嘉医疗科技有限公司，采集20例正常人的宫颈细胞，使用低渗纸片法制备玻片，然后建立试验阈值，严格按照说明书进行操作，实施细胞滴片制备、预处理、变性、杂交、阅片。未见上皮病变或恶性改变（NILM）、意义不明的不典型鳞状细胞与不典型腺细胞（ASCUS）、不除外高度鳞状上皮内病变的的不典型鳞状细胞（ASC-H）、宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅰ期的结果判定：细胞基因扩增检测值高于阈值为阳性，可认定为存在hTERC基因异常扩增，而检测值低于阈值可认定为阴性。

1.3 评定标准

1.3.1 人乳头状瘤病毒L1壳蛋白的评定标准[7]人乳头状瘤病毒L1壳蛋白定位于病变细胞的细胞核内时，会出现红棕色，可定性为阳性，否则为阴性。

1.3.2 人端粒酶RNA基因的评定标准[8]对20例正常人员行细胞涂片，每例计数100个，记录基因异常扩增细胞数目的百分比，异常阈值=平均数+3×标准差，结果为6.4%，高于6.4%为人端粒酶RNA基因异常扩增阳性，否则为阴性。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 液基细胞学检查结果中不同病症间临床指标的变异情况比较

依NILM、ASC-US、ASC-H、低度鳞状上皮内病变（LSIL）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）、鳞状细胞癌（SCC）、腺癌（AC）顺序，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性表达率呈先升高后降低趋势，在LSIL达到最高点（80.6%），在AC降至最低点（0.0%）。人端粒酶RNA基因阳性表达率出持续升高趋势，在SCC与AC升至最高点（100.0%）。见表1。

表1 液基细胞学检查结果中不同病症间临床指标的变异情况比较[n（%）]

2.2 液基细胞学检查结果中不同病症间临床指标的变异情况比较

正常、炎症、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宫颈癌顺序，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性表达率呈先升高后降低趋势，在CINⅠ期达到最高点（80.6%），在宫颈癌降至最低点（3.6%）。人端粒酶RNA基因阳性表达率呈持续升高趋势，在CINⅢ期升至最高点（100.0%）。见表2。

表2 液基细胞学检查结果中不同病症间临床指标的变异情况比较[n（%）]

3 讨论

宫颈癌也称子宫颈癌，指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤，是女性常见恶性肿瘤之一，不但在女性生殖器官癌瘤中占首位，而且在女性各种恶性肿瘤中也是较为多见的[9-10]。发病原因目前尚不清楚，早婚、早育、多产及性生活紊乱的妇女有较高的患病率。宫颈癌与多种因素有关，其中关键因素之一就是高危型人乳头状瘤病毒的持续感染。

人乳头状瘤病毒存在多种亚型，可诱发不同组织学分型的宫颈病变，其中低危型人乳头状瘤病毒感染可造成良性皮肤表现或外生殖器疾病良性表现，例如疣。高危型人乳头状瘤病毒感染往往会造成癌的发生，很多宫颈癌患者可检测到人乳头状瘤病毒16亚型或18亚型，因而认为持续感染的高危型人乳头状瘤病毒致癌基因表达是宫颈癌发生的重要因素之一[11-12]。但并非所有的人乳头状瘤病毒感染患者会发生宫颈癌。

在不同种属的人乳头状瘤病毒中，其主要的衣壳蛋白为人乳头状瘤病毒L1壳蛋白，占人乳头状瘤病毒表面蛋白的90%以上，这对于完整病毒颗粒的合成是具有决定性作用的，也是病毒感染细胞的主要靶位，还是机体免疫反应攻击人乳头状瘤病毒的主要靶位。当病毒处于增值状态时，病因基因未整合到宿主细胞上，细胞可正常分化，L1壳蛋白表达正常，能激发机体细胞免疫系统对感染细胞的识别和清除。因而在疾病发展的前期，随着病症的恶化，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性率会明显增加。

当病因基因整合到宿主细胞上，病毒处于整合状态，细胞分化受到阻碍，L1壳蛋白无法正常表达。而L1壳蛋白缺失会让宫颈免疫效应减弱，同时失去了攻击人乳头状瘤病毒的靶位，机体将无法识别并清除变异细胞，使得异常增值细胞得以生存，造成了疾病的进一步恶化。此时宫颈上皮内瘤变细胞逃脱了细胞免疫系统的监测和清除功能，可持续存在并进展为癌，而此时L1壳蛋白无法合成，将显著降低。因而认为人乳头状瘤病毒L1壳蛋白在病因基因整合到宿主细胞以后，会出现显著降低的趋势，直到发展为癌。

端粒酶是目前较为常见的恶性肿瘤分子标志物，在肿瘤发生发展过程中发挥着重要作用。人端粒酶RNA基因是疾病进展的潜在分子标志物[13-14]，其扩增可能与高级别宫颈病变有关。端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，是由RNA与蛋白质组成的依赖RNA的DNA聚合酶，这是一种特殊的逆转录酶，它能以自身携带的RNA为模板，然后逆转录合成DNA，再加至染色体末端，从而维持端粒长度的稳定性。正常情况下，体细胞和组织端粒酶是阴性的，当其发生激活时，端粒酶可以自身RNA为模板合成端粒DNA，已补充细胞分裂时端粒的缩短，因而，当细胞发生无限增殖时，细胞会出现永生化，最终诱发癌。端粒酶活化是宫颈癌发生的必经之路，在肿瘤的发生发展过程中，需要端粒酶的参与，病症越严重，人端粒酶RNA基因的阳性表达率越高。

此研究结果表明，按NILM、ASC-US、ASC-H、LSIL、HSIL、SCC、AC顺序，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性表达率呈现出先升高后降低趋势，在LSIL达到最高点（80.6%），在AC降至最低点（0.0%）。人端粒酶RNA基因阳性表达率呈持续升高趋势，在SCC与AC升至最高点（100.0%）。依正常、炎症、CINⅠ期、CINⅡ期、CINⅢ期、宫颈癌顺序，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白阳性表达率呈先升高后降低趋势，在CINⅠ期达到最高点（80.6%），在宫颈癌降至最低点（3.6%）。人端粒酶RNA基因阳性表达率出持续升高趋势，在CINⅢ期升至最高点（100.0%）。说明无论是液基细胞学检查，还是阴道镜活检，都显示宫颈癌发展的不同阶段，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和人端粒酶RNA基因会发生不同程度的改变，两种结合检测可对疾病进行准确定性。这与诸多研究的结果是相似的，陆萍等[15]研究结果显示，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白在宫颈上皮内瘤变中的阳性表达随病变程度的加重而呈下降趋势，提示其有望成为预测宫颈癌前病变程度的标志物，对于宫颈癌前病变的筛查和预防具有重要的意义。林志新等[16]研究结果显示，hTERC基因FISH检测与HR-HPVHCⅡ检测比较能更可靠地辨别宫颈病变的程度，检测hTERC基因扩增对判断早期宫颈病变进展风险可能有一定的预测意义，有望作为宫颈癌早期筛查、病情判断和评估预后的辅助指标之一。

综上所述，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白联合人端粒酶RNA基因检测，在宫颈癌前病变中具有较高的指导价值。此次研究也存在一定弊端，样本量较少，需要进一步扩大，人乳头状瘤病毒L1壳蛋白和人端粒酶RNA基因联合检测能否对所有宫颈疾病进行准确定位和定性，尚需进一步研究。

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Significance of human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection in cervical cancer screening

WANG JuanLI YanZHAO JundaMA Junqi▲
Gynecological Clinic,Gynecological Assisted Reproductive Center,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi830000,China

Objective To investigate significance of human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection in cervical cancer screening.Methods From October 2012 to October 2014,in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,627 patients given cervical cancer screening were selected.Firstly,the patients received liquid based cytology,then they received colposcopy and biopsy,at the same time,they also received human papilloma virus L1 protein detection and human telomerase RNA gene detection.The variation of clinical indicators were analyzed between different conditions.Results According to sequence of NILM,ASC-US,ASC-H,LSIL, HSIL,SCC,AC,positive expression ratio of human papilloma virus L1 protein were 18.6%,42.9%,51.0%,80.6%, 47.4%,5.9%,0.0%,the difference was statistically significant(χ2=93.770,P＜0.01),which showed increasing at first and then decreasing,it reached highest point at LSIL,and reached lowest point at AC;positive expression ratio of human telomerase RNA gene were 0.0%,19.9%,36.3%,51.6%,94.7%,100.0%,100.0%,the difference was statistically significant(χ2=279.564,P＜0.01),which showed continue increasing,it reached highest point at SCC and AC.According to sequence of normal,inflammation,CIN phaseⅠ,CIN phaseⅡ,CIN phaseⅢ,cervical cancer,positive expression ratio of human papilloma virus L1 protein were 18.6%,46.1%,80.6%,53.3%,25.0%,3.6%,the difference was statistically significant(χ2=93.015,P＜0.01),which showed increasing at first and then decreasing,it reached highest point at CIN phaseⅠ,and itreached lowest point at cervical cancer;positive expression ratio of human telomerase RNA gene were 0.0%,26.4%,51.6%,93.3%,100.0%,100.0%,the difference was statistically significant (χ2=269.582,P＜0.01),which showed continue increasing,it reached highest point at CIN phaseⅡ.Conclusion Human papilloma virus L1 protein and human telomerase RNA gene combined detection has higher guiding value in cervical precancerous lesions.

Human papilloma virus L1 protein;Human telomerase RNA gene;Cervical cancer

R737.33

A

1673-7210（2015）06（b）-0060-04

2015-02-10本文编辑：苏畅）

王娟（1982.11-），女，硕士研究生；研究方向：宫颈病变的诊疗。

▲通讯作者