DC-CIK细胞与顺铂对乳腺癌细胞杀伤作用的研究

底玮 沈方臻

青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003

DC-CIK细胞与顺铂对乳腺癌细胞杀伤作用的研究

底玮 沈方臻

青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003

目的研究DC-CIK细胞和不同浓度顺铂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用。方法将DC细胞和CIK细胞共同培养得到的DC-CIK细胞与顺铂分别作用于MCF-7细胞，共同培养12h、24 h和48 h，MTT法检测MCF-7细胞的增殖抑制情况，对比DC-CIK细胞和顺铂对MCF-7细胞的增殖抑制效果。结果与DC-CIK细胞共培养12 h、24 h与48 h，MCF-7细胞均出现一定的凋亡，增殖受到明显的抑制；与5×106个DC-CIK细胞共培养12h与40 ng/mL顺铂对其作用12 h的抑制效果相同，共培养24 h与50 ng/mL顺铂对其作用24 h的效果相同，共培养48 h与60 ng/mL顺铂对其作用24 h的效果相同。结论该研究为DC-CIK法治疗乳腺癌作出了实验室基础性研究，为临床DC-CIK细胞抑制乳腺癌细胞提供了理论依据。

树突状细胞；细胞因子诱导的杀伤细胞；DC-CIK细胞；乳腺癌；免疫治疗

树突状细胞（Dendritic cells，DC）是机体内重要的抗原提呈细胞，可激发B和T淋巴细胞介导的免疫反应[1]。细胞因子诱导杀伤细胞（cytokine-induced killer cell，CIK）是将人外周血单个核细胞在体外与多种细胞因子及抗体共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，对肿瘤细胞具有高效的溶解毒性[2]。DC能识别处理肿瘤细胞，并把肿瘤细胞的相关信号传递给CIK细胞，使之发挥杀伤肿瘤细胞的功能。因此，DC能显著提高CIK细胞针对肿瘤细胞的杀伤活性[3]。[A1]本次实验的起止时间为2012年10月-2013年7月，实验从正常人外周血中分离DC和CIK，来诱导培养DC、CIK产生DC-CIK细胞，然后通过对比DC-CIK细胞和化疗药物顺铂对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制效果，来探索一种更为有效的免疫治疗方法，为临床研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

DMEM（Eagle medium and modified Eagle medium）（Gibco Invitrogen公司）；Fetal bovine serum（Gibco Invitrogen公司）；penicillin and streptomycin（Gibco Invitrogen公司）；trypsin 0.25%with EDTA（Gibco Invitrogen公司）；7.5%BSA（Gibco Invitrogen公司）；IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α及CD3单抗（Cytolab公司）。

1.2 方法

1.2.1 CIK细胞的诱导和扩增取健康成年人外周全血30 mL，用等量Ficol1分离出PBMC。调细胞浓度为1×106/mL，置于37℃、5%CO2培养箱培养2h。收集非贴壁细胞，用含10%人AB血清的IMDM调细胞浓度为1×106/ml，并加人1000 U/mL的IFN-γ悬浮培养，24h后加入50ng/mL的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，每隔3 d半量换液1次，补充rhIL-2，调整细胞浓度始终为1×106/mL。在培养的第7 d，收获CIK细胞。然后加入新鲜DMEM完全培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。

1.2.2 DC的体外培养在PBMC培养2 h之后的贴壁细胞中，加入含1000 U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4的GT-T551无血清培养液，37℃、5%CO2培养箱培养。每3 d换液1次并补充细胞因子，诱导单核细胞向DC细胞分化，在培养的第7 d，加入500U/mL重组人TNF-a，诱导DC细胞成熟；共培养到第9 d。收获DC细胞。

1.2.3 DC与CIK细胞共培养将DE与CIK细胞混合，比例为DC：CIK=1：5，培养液为CIK培养液。无血清培养液中添加重组人IL-2(300 U/mL)。

1.2.4 细胞传代培养采用冻融法。消化收集对数生长期的MCF-7细胞，用PBS液离心洗涤2遍，再用PBS液重悬为1×107/mL，封装入冻存管。

1.2.5 DC-CIK作用于MCF-7将MCF-7细胞稀释为5×105个细胞/mL的浓度，每孔100 μL加入96孔板培养24 h。将培养好的DC-CIK细胞，稀释为5×106/mL及10×106/mL的浓度，每孔100 μL加入到已经培养24 hMCF-7细胞的96孔板中，置于37℃CO2培养箱共同培养。每个组共设5个重复孔。在共培养时间上分为12、24和48h3个组别。每个96孔板上均设置空白对照组，对照组不干预。

1.2.6 顺铂作用于MCF-7将顺铂加入到已经培养24 hMCF-7细胞的96孔板中，使顺铂在96孔培养板中的终浓度依次为10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、60 ng/mL、70 ng/mL、80ng/mL、90 ng/mL、100ng/mL。然后加入培养基补足够200 μL。置于37℃CO2培养箱共同培养。每个组共设5个重复孔。在共培养时间上分为12、24和48h3个组别。每个96孔培养板上均设置空白对照组。

1.2.7 MTT检测MCF-7的增殖在转染12、24、48 h后采用MTT法检测MCF-7细胞的凋亡情况。将各组细胞制成浓度为2000个/ml的细胞悬液，然后将200 μL/孔的细胞悬液接种到96孔板中继续培养，在12 h后每孔加入20 μLMTT（5 mg/mL），再在37℃条件下培养4 h；弃去上清液，每孔加入DMSO为150μl，37℃条件下振荡15 min，使用酶标仪490 nm波长测定A值。并记算各组的杀伤率。杀伤率=[1-(实验孔A值-效应细胞对照孔A值)/靶细胞对照孔A值]×100%。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 DC-CIK作用于MCF-7后MCF-7的增殖情况

在显微镜下观察MCF-7细胞增殖情况。在加入DC-CIK后，MCF-7细胞出现了部分凋亡现象，对照组MCF-7细胞呈现正常生长状态。

在使用MTT法检测DC-CIK作用于MCF-7后12、24、48h细胞增殖情况显示，加入5×106/mLDC-CIK细胞后，MCF-7细胞的凋亡率分别为18.3%、26.0%、35.6%，加入10×106/mLDC-CIK细胞后，MCF-7细胞的凋亡率分别为25.8%、42.3%、58.6%，对照组为3.5%，杀伤作用与作用时间及效靶比均呈正相关，L＜0.05。

2.2 化疗药物顺铂作用于MCF-7后的增殖情况

化疗药物顺铂作用与MCF-7细胞后显示出对增殖的明显抑制作用，而且随着作用时间及顺铂浓度的增加，抑制的效果也越明显。L值均＜0.01。

表1 不同顺铂浓度对MCF-7细胞增殖抑制情况

2.3 DC-CIK和顺铂对MCF-7增殖抑制作用的比较

将DC-CIK和顺铂对MCF-7增殖抑制作用的进行比较，结果显示，5×106个细胞对MCF-7细胞增殖12 h的抑制作用与40 ng/ml浓度的顺铂对MCF-7细胞增殖12 h的抑制作用相等同，而作用24 h的抑制作用与50 ng/mL顺铂对MCF-7细胞增殖24 h的抑制作用相等同，作用48 h的的抑制作用与60 ng/mL顺铂对MCF-7细胞增殖24 h的抑制作用基本相等同。

图1 DC-CIK和顺铂对MCF-7增殖抑制作用的比较情况[A2]

3 讨论

DC-CIK细胞具有很多优点，对原发性、转移性肿瘤均有良好的疗效，并且对多重耐药、放化疗无效的肿瘤细胞也有效；可以明显的预防肿瘤的复发；能够显著地提高机体免疫力，激发全身性的抗癌效应[4-5]。目前DC-CIK细胞对乳腺癌细胞作用的研究还处在起步阶段，刘苗等[6]研究发现，DC-CIK细胞在体外可以大量增殖，溶瘤作用强。另有研究表明，CIK细胞的溶瘤率为15%，而DC-CIK细胞溶瘤率可以达到71%，且能诱导机体分泌高水平的IFN-γ，可调节和增强机体的免疫功能，提高间接杀瘤作用[7-8]。该研究着眼于实验室基础性研究，通过DC-CIK细胞对乳腺癌MCF-7细胞增殖的体外作用实验，发现DC-CIK细胞对MCF-7细胞增值存在很好的抑制作用，杀伤癌细胞作用与作用时间及效靶比均呈正相关；在某一浓度与作用时间上，DC-CIK细胞与顺铂对MCF-7细胞的抑制有相同作用，DC-CIK细胞对MCF-7细胞具有与顺铂类似的增殖抑制作用，并且，该研究结果提示DC-CIK法可以取得化疗药物相同的对乳腺癌细胞的增殖抑制作用，且无化疗药物的副作用，为进一步临床实验打下了坚实的基础，在临床治疗乳腺癌方面具有很高的应用价值。

目前，DC-CIK细胞在成人肿瘤的临床治疗已经开展，但开展时间较短，数据也不丰富，需继续扩大DC-CIK细胞治疗的临床应用范围，以获取更多的临床资料。另外，DC-CIK细胞与天然药物、其它药物，甚至疫苗结合杀伤肿瘤细胞也是一个很好的研究方向。曲佳等[9]将冬凌草甲素与DC-CIK细胞结合杀伤人多发性骨髓瘤RPMI 8266细胞，发现冬凌草甲素能明显提高DCCIK细胞的杀瘤活性。李雄兵等[10]将卡介苗与DC-CIK细胞联合应用于裸鼠结肠癌肝转移的抑制作用，取得了良好的效果，也为DC-CIK细胞的临床应用提供了宝贵的经验。

综上所述，随着医学生物科技的迅猛发展，细胞免疫治疗逐渐成为一种崭新的治疗模式，尤其是DC-CIK细胞，目前已经小规模应用于临床治疗恶性肿瘤，并取得了很好的治疗效果。在目前的癌症多学科综合治疗理念下，为使乳腺癌患者获得最佳的治疗效果，在接受手术、放化疗等标准治疗后，细胞免疫治疗不失为一种比较可取的辅助治疗手段，而DC-CIK细胞将成为首选方案。该疗法可单独用于治疗，也适宜作为手术或放化疗后的辅助疗法，以提高疗效和改善生存质量。因此，该法已成为肿瘤治疗的手段之一，为预防肿瘤复发、消除患者体内残留的肿瘤细胞、改善晚期肿瘤患者的生存质量提供了新的治疗途径。

[1]尤渺宁，任军，邱立军，等.树突状细胞体腔回输治疗恶性体腔积液的疗效观察及护理[J].护士进修杂志,2013,28(1):87-88.

[2]于卉影，孙英慧，蔺迪,等.肿瘤患者自体CIK细胞输注增强再次制备时CD3+CD56+细胞的体外扩增能力[J].细胞与分子免疫学杂志, 2014,30(7):748-753.

[3]王睿斌，郝筱诗，齐保聚，等.晚期直肠癌患者DC-CIK免疫干预前后D二聚体改变的临床研究[J].2014,18(2):247-250.

[4]匡幼林，邓远忠，梁思敏，等树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞抗前列腺癌细胞的免疫效应[J].重庆医学,2014,43,(17):2167-2169.

[5]龚奕,陈幸华,张曦,等.DC-CIK细胞输注治疗急性髓细胞白血病50例分析[J].重庆医学,2011,40(30):3039-3041.

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[9]曲佳，詹星，冯可欣，等.冬凌草甲素联合DC-CIK细胞杀伤RPMI 8266细胞的研究[J].实用医学杂志,2014,30(14):2208-2210.

[10]李雄兵,刘汉锋,蔡正文,等.卡介苗联合DC-CIK细胞对裸鼠结肠癌生长及肝转移的抑制作用[J].2014,36(4):424-427.

The Expermenal Study of the Cytotoxicity to Breast Cancer Cell Line Using DC-CKI Cells and Cis-platinum

Di WeiSHEN Fangzhen
Affiliated Hospital of Medical College,Qingdao University,Qingdao,Shandong，266003，China

ObjectiveTo investigate the in-vitro inhibitory efects of DC(dendritic cel1)-CIK(cytokine-induced killer cel1)cocultured cells and cis-platinum against breast cancer cell line MCF-7 cells.MethodsIn this study,the DC cells and CIK cells cocultured DC-CIK cells and in MCF-7 cells co-cultured for 12,24 and 48 hours,using the MTT assay MCF-7 cell proliferation inhibition and using different concentrations the chemotherapy drug cisplatin role in MCF-7 cells,using the same MTT assay MCF-7 cell proliferation inhibition.Then compare the inhibitory effect of DC-CIK cells and the chemotherapy drug cisplatin proliferation of MCF-7 cells.ResultsAddition of DC-CIK cells using MTT assay DC-CIK role in the MCF-7 cell proliferation of MCF-7 before and after the show,regardless of the role of 12,24 or 48 hours,MCF-7 cells apoptosis,proliferation was significantly inhibited.DC-CIK and cisplatin on MCF-7 proliferation inhibition comparison,5×106 cells proliferation of MCF-7 cells 12h inhibition with 40 ng/mL concentration of cisplatin on the proliferation of MCF-7 cells for 12h inhibition equivalent for 24h inhibited with 50 ng/mL cisplatin equivalent to the inhibition of proliferation of MCF-7 cells 24h,48h role in the inhibition of 60 ng/ ml of cisplatin on the proliferation of MCF-7 cells the 24h of inhibition basic equivalent.The results show that the DC-CIK cells to inhibit the proliferation of MCF-7 cells.ConclusionThis study DC-CIK therapy for breast cancer made a laboratory for basic research.In the clinical treatment of breast cancer has a theoretical and experimental basis.

Dentritic cell;Cytokine induced killer;Dentritic cell co-cultured cells with cytokine induced killer;Breast Cancer; Immunotherapy

R73

A

1674-0742（2015）03（b）-0124-03

2014-12-25）

底玮（1969-）女，河南偃师人，研究生，副主任医师，主要从事肿瘤内科临床工作。

沈方臻，女，主任医师，研究方向：恶性肿瘤生物治疗。