益肝降脂方预处理对酒精性脂肪肝SD大鼠肝脏PKCα表达的影响

侯珊珊赵远红贾英杰李 正李小江李全征尹纪红张小瑞杨彩霞顾宏韬

（1.天津中医药大学，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193；3.天津市中医药研究院附属医院，天津300120）

益肝降脂方预处理对酒精性脂肪肝SD大鼠肝脏PKCα表达的影响

侯珊珊1赵远红2贾英杰2李 正2李小江2李全征1尹纪红1张小瑞1杨彩霞1顾宏韬3

（1.天津中医药大学，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193；3.天津市中医药研究院附属医院，天津300120）

目的：观察中药益肝降脂方预处理对酒精性脂肪肝SD大鼠肝脏蛋白激酶Cα（PKCα）基因与蛋白表达的影响，探讨益肝降脂方对酒精性脂肪肝内源性保护机制的诱发与强化的效应。方法：将116只SD大鼠随机分为模型组与中药干预组，所有大鼠均连续12周予高脂+酒精灌胃进行酒精性脂肪肝造模，中药组分别于实验第3周、第6周、第9周起实施干预。于实验6、9、12周末不同时段宰杀取样，观察大鼠的一般情况及肝脏组织病理学变化以评价造模，蛋白免疫印迹法（Western blot）观测PKCα蛋白表达量，RT-PCR法检测PKCαmRNA的表达活性。结果：HE染色显示模型组大鼠肝小叶结构改变，肝细胞索紊乱，肝细胞呈不同程度的脂肪变性、点状坏死及炎性细胞浸润；中药各干预组大鼠肝组织脂肪变均较模型组明显改善。中药各时段干预组大鼠肝组织PKCα蛋白含量与模型组比较均明显升高，PKCαmRNA的相对表达量明显高于模型组，且PKCαmRNA相对表达量随用药时间的先后呈进行性降低。结论：中药益肝降脂方早期干预能促进PKCα基因和蛋白的表达，有显著的药物预适应作用；益肝降脂方的预适应作用与用药早晚成正相关；中药益肝降脂方防治酒精性脂肪肝的机制可能与早期促发内源性保护实现预适应相关。

益肝降脂方 酒精性脂肪肝 蛋白激酶Cα 实验研究

益肝降脂方是我们临床应用多年具有升清降浊解郁功效的经验方，能有效调节酒精性肝病（ALD）的血脂代谢，降酶保肝，改善中医症状[1]。本课题前期实验已证实益肝降脂方具有类抗氧化剂样效应，能起到防护酒精性脂肪肝 （alcoholic fatty liver，AFL）的作用[2]。蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）属丝氨酸/苏氨酸激酶家族中的一种，是细胞内外不同刺激信号转导的关键环节，目前由于其在肝细胞缺血/低氧预适应内源性保护机制中的作用而受到人们的广泛关注。药物预适应（pharmacologic preconditioning，PPC）是用药物模拟缺血预适应中的介质，使其产生预处理效应，是减轻缺血再灌注损伤，保护组织的一种有效方法[3]。中药具有安全范围大、不良反应小、作用靶点多等优点，目前关于中药在肝脏预适应保护作用中的报道很少，且中药预处理的作用机制复杂，尚未阐明。本研究在前期实验证实益肝降脂方保肝降脂抗氧化作用的基础上，尝试通过不同时间的干预造模，观察PKCα基因和蛋白的表达，分析中药复方预处理是否诱导或协助产生预适应样效应，探讨PKCα在大鼠酒精性脂肪肝中的表达以及益肝降脂方对酒精性脂肪肝的保护作用是否与诱导促进PKCα的表达有关，为益肝降脂方防治ALD建立理论基础。

1 实验材料

1.1 动物 SPF级成熟雄性SD大鼠116只，（180± 20）g，购自中国人民解放军军事医学科学院，合格证：0023015，许可证：SCXK-（军）2007-004，饲养于天津中医药大学第一附属医院实验动物房。

1.2 药物 益肝降脂方药（黄芪∶葛根∶丹参∶苏叶∶黄连∶水红花子=2∶3∶1∶1.3∶0.8∶2）由本院制剂室按比例规范制备成中药浸膏（含生药1.33g/mL）。

1.3 试剂 PKC鼠抗人单克隆抗体（sc-8393）购自Santa Cruz公司，山羊抗小鼠IgG（ZB2305）、山羊抗兔IgG（ZB2301）、β-actin鼠抗人单克隆抗体 （TA-09）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，组织蛋白抽提试剂盒 （BSP003）、高灵敏ECL发光试剂盒（PW044）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒（PC0020）、丽春红染色试剂（P0012）、PVDF膜（ISEQ00010）、Western blot封闭液Ⅱ （奶粉，pH7.5）（PC0020）、TBS（pH8.0，20×）（T1080）、SDS-PAGE上样缓冲液 （还原，4×）（P1015）均购自北京索莱宝科技有限公司，Western Show预染蛋白Marker（sm0671）由Thermo提供。高脂饲料（1%胆固醇，10%猪油，0.3%胆酸钠，8%蛋黄粉，80.7%基础饲料）由中国医学科学院放射医学研究所提供；体积分数56%牛栏山二锅头白酒（北京顺鑫农业股份有限公司）。

1.4 主要仪器 分光光度计 （上海722RS型），LAUDA-C3型循环恒温水浴箱 （泰克仪器有限公司），光学显微镜 （日本OLYMPUS公司），Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System（BIO-RAD USA），BIO-RAD ChemiDoc XRS凝胶成像系统（BIO-RAD USA），Powerpac Basic电泳仪 （BIORAD USA），温控摇床（New Brunswich USA），ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪。

2 实验方法

2.1 动物分组 在完成前期综合评价益肝降脂方对实验大鼠酒精性脂肪肝的药效学研究后，本实验参照前期造模成功实验结合本期研究目的未设立正常对照组[4]，将116只SD大鼠适应性喂养1周后随机分为模型组22只，中药干预组94只（其中第3周干预组35只，第6周干预组31只，第9周干预组28只），饲养温度18～22℃，相对湿度40%～70%。

2.2 造模与给药 连续12周予SD大鼠高脂+酒精梯度灌胃进行酒精性脂肪肝造模，酒精剂量为1.5mL/100g，按每周测得体重每日早晚灌胃2次（时间间隔8h以上），酒精体积分数初起为40%（4.8g·kg-1·d-1）并持续至第4周末，后增加至45%（5.4g·kg-1·d-1）至第8周末，第9周开始增加至50%（6.0g·kg-1·d-1）持续到12周末实验结束（适应性饲养不计入实验周）。酒精性脂肪肝造模的同时，中药干预组按药理实验方法学计算[5]，分别于第3周、第6周及第9周开始，酒精灌胃0.5h后，分别灌服中药浸膏2mL，2次/d。

2.3 取材 分别于实验第6周、9周、12周末随机抽取各组大鼠数只，前1d禁食12h，自由饮水，于第2天称重后乙醚麻醉，目内眦取血后，3000r/min离心10min，分离血清，4℃冷藏。取血后迅速解剖，取下肝脏，在肝右叶部分距边缘5mm处取0.8cm× 0.8cm×0.8cm大小肝组织2块，分别放入洁净的EP管中密封，-80℃冷藏；取肝左叶组织大小约1.0cm× 0.3cm×0.3cm一块，浸泡于4%多聚甲醛中固定，切片行HE染色后，在显微镜下观察肝组织的脂肪变、炎症活动以及纤维化情况。

2.4 观察及指标测定方法

2.4.1 动物表现 每周测体重1次，每日观察并记录各组大鼠的精神、皮毛光泽、进食、大小便及饮酒情况。

2.4.2 内源性保护的媒介物质PKCα测定

2.4.2.1 蛋白免疫印迹法（Western blot）测定肝组织PKCα蛋白的表达 提取肝组织中总蛋白，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，根据SDS-PAGE上样量需要，取适量样品加入4×loading buffer后，100℃煮沸变性5min。浓缩胶恒压80V，约40min；分离胶恒压120V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。设置恒流300mA，冰浴转膜2h。转膜后用丽春红染色试剂对膜染色，观察转膜效果。将膜浸没在Western blot封闭液Ⅱ（TBST溶解的5%脱脂奶粉，pH7.5）中室温轻摇90min（封闭液须覆盖整张膜，且膜在其中能够摇动为宜）。用Western blot封闭液Ⅱ稀释一抗，室温孵育30min，放4℃过夜，TBST洗膜7次。用Western blot封闭液Ⅱ稀释二抗，目的蛋白用羊抗鼠-HRP 1∶10000或羊抗兔-HRP 1∶10000（根据一抗进行选择）室温孵育60min，TBST洗膜7次；内参用羊抗鼠 β-Actin 1∶1000，室温孵育30min，放 4℃过夜，洗膜 7遍，再加羊抗鼠-HRP 1∶10000二抗，室温孵育60min，洗膜7次。分别用ECL试剂盒显色，暗室显影。用KS400图像分析系统进行灰度扫描，目的条带的光密度值与相应内参照β-actin的光密度比值即为目的蛋白表达的相对表达值。

2.4.2.2 实时荧光定量PCR检测肝脏PKCαmRNA的表达 使用Trizol法提取肝脏组织总RNA，电泳检测提取RNA的完整性，参照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA，收集cDNA-20℃保存，参照UItraSYBR二步法荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR，以GAPDH为内参基因，相同模板相同基因设3复孔，3次平行实验，得到各扩增反应的CT值。引物序列由Primer Premier5.0软件在线设计，管家基因（GAPDH）引物序列——F：CAAGTTCAACG鄄GCACAGTCAA，R：CGCCAGTAGACTCCACGACA，产物长度为140bp；PKCα引物为——F：CAGTGC鄄CAAGTTTGCTGTTTT，R：ATCAGTGTCAGGTCCCT鄄TATCC，产物长度为93bp。PCR反应条件：95℃2min，95℃ 10s，60℃ 40s，40个循环。

2.4.3 肝脏组织病理形态学观察 肉眼观察肝脏的大小、颜色、质地等外观情况，取小块用4%多聚甲醛固定的肝组织，经过酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色封片后，在光学显微镜下观察组织结构及肝脏细胞脂肪变性及炎症浸润程度，病理组织学诊断参考《酒精性肝病诊疗指南》[6]。

2.5 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件处理，计量资料结果以（±s）表示，计量资料选用多样本单因素方差分析，等级资料选用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

实验结束时，116只大鼠共死亡16只，其中模型组9只，第3周干预组2只，第6周干预组3只，第9周干预组2只。死因经术后病理解剖证实，主要为灌胃不当或反复酒精灌胃后返流入食道吸入肺部误入气管所致。

3.1 各组大鼠一般情况 初期各组大鼠精神状况正常，皮毛光泽，饮食正常；灌酒后约15min后均出现行动迟缓、不同程度嗜睡、喜卧的状态；随造模时间延长，模型组大鼠皮毛干枯蓬乱、无光泽，易激惹，食量减少，大便偏稀，中药组大鼠皮毛蓬乱、欠光泽，易激惹，但程度明显轻于模型组，大便偏软色深呈黑色，灌酒后行动迟缓，但少见嗜睡或嗜睡时间较模型组大鼠缩短。

3.2 PKCα蛋白在各组中的表达情况 Western Blot结果显示，与模型组相比，中药干预组大鼠肝脏PKCα蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且第3周干预组与第6周干预组、第9周干预组比较明显升高（P＜0.05），中药干预组PKCα蛋白表达水平随开始用药时间的延迟呈进行性下降。见图1。

3.3 各组大鼠PKCαmRNA的水平变化 中药各干预组PKCαmRNA相对表达量均显著高于模型组（均P＜0.05），且中药各干预组之间比较也存在明显差异（均P＜0.05）。PKCαmRNA相对表达量在中药各干预组中随开始用药时间的延迟呈进行性下降。见图2。

图1 益肝降脂方对SD大鼠肝脏PKCα蛋白表达的影响

图2 各组大鼠肝脏PKCαmRNA的表达

3.4 各组大鼠肝脏病理情况 肉眼观察：模型组大鼠肝脏色泽较正常肝脏色暗淡，表面粗糙，表面及切面呈灰黄色或布有白色脂肪斑点，质地较脆韧，被膜与周围组织粘连，包膜紧张，边缘钝而厚；中药干预组大鼠肝脏呈红褐色，质地稍软，肝脏薄膜与周围组织有轻度粘连，边缘稍钝。

HE染色后光镜下观察，实验结束时 （12周末）各组病理形态表现——模型组：肝小叶结构改变，肝细胞内出现大小不等的脂滴，细胞胞质呈现空泡状，可见F3-4级脂肪变，肝窦略狭窄，病变以中央静脉周围最明显，汇管区有炎性细胞浸润，散在点状坏死，个别标本肝血窦周围可见纤维组织轻度增生。第3周干预组（用药9周）：肝小叶结构完整，肝细胞边界较清，中度水样变性，大鼠肝组织多表现为F1-2级脂肪变，汇管区少量炎性细胞浸润，肝小叶内偶见点状坏死，未见纤维化和肝硬化形成。第6周干预组（用药6周）：肝小叶结构较规则，可见肝细胞体积增大，肝血窦变窄，多见混合型的脂肪变性，可见少量嗜酸性变、点状坏死，汇管区可见大量炎性细胞浸润及纤维增生。第9周干预组（用药3周）：肝小叶结构不规则，肝细胞体积增大，胞质淡染，染色质呈颗粒状，甚至呈气球样变，肝血窦变窄，可见广泛的混合型脂肪变性，中央静脉周围散在点状坏死，汇管区可见大量炎性细胞浸润及纤维增生。见图3。

图3 各组大鼠肝脏病理组织学变化（HE，×100）

4 讨论

蛋白激酶C（PKC）是细胞信号转导途径中的重要物质，其PKCα为经典型PKC，主要存在于胞质中，以Ca2+依赖形式从胞质中转位到细胞膜上而被激活[7]，并导致一系列信号通路的开放，是重要的第二信使。研究发现在预处理对人肝细胞的保护作用中，PKC通路激活和预处理导致细胞保护作用是密切相关的，PKC的激活参与了细胞保护[8]。本研究在建立酒精性脂肪肝大鼠模型的同时予以中药益肝降脂方不同时间点干预，观察比较PKCα基因和蛋白在各组大鼠肝脏中的表达，探讨益肝降脂方是否具有预适应样效应。

药物预适应是指通过药物激发或模拟机体内源性物质，而呈现的保护作用。药物预处理的研究是基于对缺血预处理（IPC）保护机制的理解，因其可以有效避免IPC的有创性损伤，简单易行，且便于控制剂量，目前已引起普遍关注，且具有广泛的临床应用价值。预适应样保护的信号传导路径分三个环节：触发物质—中介物质—效应物质[9]。触发物质主要是指预处理性短暂缺血时机体释放的内源性活性物质，在受体水平发挥调节作用；中介物质以受体后多种蛋白激酶为主；效应物质主要包括产生终末效应的细胞保护蛋白和离子通道。PKC通路激活在预适应保护信号传导通路中发挥重要作用，是下游效应物质发挥延迟保护作用的前提。

本研究采用高脂饮食联合酒精灌胃法成功诱导SD大鼠AFLD模型，并以中医不同时间点的干预模拟药物预处理方式，结果肝脏组织病理学显示，益肝降脂方各干预组肝脏组织改变较模型组轻，两者存在差异。通过蛋白免疫印迹可以看出，中药干预组大鼠肝组织PKCα蛋白较模型组高表达，且用药越早，蛋白表达相对越多，各组间比较差异有统计学意义 （P＜0.05）。 各组大鼠肝脏中PKCαmRNA的表达结果显示，中药干预组PKCαmRNA的相对表达量明显高于模型组，两者存在显著性差异 （P＜0.05）；中药各干预组组间比较，第3周干预组PKCαmRNA表达水平高于第6周干预组（P＜0.05），第6周干预组PKCαmRNA表达水平高于第9周干预组（P＜0.05）。可见PKCα蛋白和mRNA的表达随用药时间的先后，其表达量逐渐降低，PKCα蛋白和基因的表达与中药干预时间的早晚呈正相关，表现出明显的时、效一致趋势。推测针对酒精性脂肪肝早期予益肝降脂方干预，能促进内源性保护媒介物之一PKCα蛋白和基因的表达，从而诱导出预适应样效应，PKCα可能参与了益肝降脂方对酒精性脂肪肝的保护作用。

总之，PKCα是应激性肝损伤时内源性保护信号传导路径的关键物质，益肝降脂方不同时间干预可影响酒精性脂肪肝SD大鼠肝组织中PKCαmRNA和蛋白的表达，中药用药越早PKCα蛋白及mRNA表达越强，其防治酒精性脂肪肝的机制可能与早期促发内源性保护实现预适应相关。

[1] 赵远红，贾英杰，董承超，等.益肝降脂方预处理对早期酒精性肝损伤的保护作用研究.天津中医药，2010，27（3）：封三

[2] 韩素恒，赵远红，董承超，等.益肝降脂方药对酒精诱导SD大鼠脂肪肝的干预效应与分析.四川中医，2013，31（8）：40

[3] 黄诗栋，郭光伟.药物预适应的心肌保护作用.山西医科大学学报，2006，37（3）：325

[4] 徐雨，赵远红，左小娜，等.高脂加酒精灌胃法诱导大鼠脂肪肝成模及思考.时珍国医国药，2012，23（12）：2986

[5] 陈奇.中药药理研究方法学.北京：人民卫生出版社，1993：33

[6] 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.酒精性肝病诊疗指南（2010年1月修订）.现代医药卫生，2011，27（6）：801

[7] 董瓅瑾，赵艳威，杨彩凤，等.蛋白激酶Cα结构及其组织分布.武警医学院学报，2011，20（11）：918

[8] 单毓强，高毅，王瑜，等.蛋白激酶c在肝细胞缺氧预处理中的作用.世界华人消化杂志，2003，11（6）：723

[9]Murphy E.Primary and secondary signaling pathways in early preconditioning that converge on the mitochondria to produce cardioprotection.Circ Res，2004，94（1）：7

R575.505

A

1672-397X（2015）01-0070-04

侯珊珊（1989-），女，硕士研究生，研究方向：中医内科学肿瘤方向。

赵远红，yuanhongzh98@163.com

2014-06-04

编辑：吴 宁

天津市应用基础及前沿技术重点项目（11JCZDJC19900）