响应面法优化火棘总酚含量测定方法

张 焕，董光耀，舒 畅，王俊杰，陈西喆，鄢又玉*

1武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023;2 湖北神农蜂语生物产业有限公司，十堰 442000

火棘［Pyracantha fortuneana (Maxim.)Li］为常绿灌木或小乔木，主产于川、滇、黔、陕、鄂、湘、粤、桂、闽、浙、皖、苏等我国南方山区及丘陵地带，资源极其丰富，目前已被国家卫生部批准作为食品新资源食用果品［1］。其果实富含多酚成分［2，3］，植物多酚具有抗氧化［4］、抗肿瘤，延缓衰老、免疫调节［5，6］等多种生物活性。

目前用于植物多酚的含量检测方法较多，主要有分光光度法［7］、近红外光谱法［8］以及色谱法［9，10］等。其中分光光度法因对设备的要求不高，操作简单而得到最广泛应用。主要包括酒石酸亚铁比色法［11］、福林酚比色法［12］和高锰酸钾滴定法［13］等，其中福林酚法应用最为广泛。但不同资料所报道的用于总酚测定的福林酚比色法检测条件却存在很大的差异［12，14-19］，主要表现在:①最大检测波长不一致，有以680、725、740、750、760、765、780 nm 等为测定波长;②福林酚试剂与碱液Na2CO3含量及比例各不相同，有1∶1、1∶2、1∶3 及1∶5 等;③Na2CO3溶液浓度差别很大，有5% (w/v)、7.5%、10%、15%、20%、饱和浓度等;④显色时间分布在30～120 min等;⑤显色温度20～60 ℃不等。因此很有必要对影响福林酚显色的因素进行系统考察，以确定最优检测条件。目前对火棘中多酚化合物的定量测定方法尚未见报道。为了更好地开发利用火棘植物中的功效成分，本文通过响应面优化建立了福林酚比色法检测火棘总酚含量的定量方法，此方法也可推广应用于其它植物总酚的含量测定。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

Lambda 25 型紫外-可见光分光光度计(美国PE公司)，CR 22G 高速冷冻离心机(日本HATACHI 公司)，Molelement1018a 型摩尔超纯水机(上海摩勒科学仪器有限公司)，万分之一电子天平(德国赛多丽斯公司);高速万能粉碎机(天津市泰斯特实验设备有限公司);HSJ 系列恒温水浴搅拌器(金坛市科析仪器有限公司);STARTER 2100 实验室pH 计(奥豪斯仪器有限公司)。

没食子酸标准品(中国药品生物制品检定所，批号:110831-201403)，福林酚试剂(sigma 公司)，碳酸钠、乙醇等均为国产分析纯。

火棘果，2014 年11 月中旬采自湖北恩施来凤地区，经华中科技大学植物学博士杨悦鉴定为全缘火棘Pyracantha atalantioides 的果实。

1.2 实验方法

1.2.1 火棘多酚提取物的制备

取干燥、粉碎过20 目筛的火棘果粉末20 g，加体积分数45%乙醇200 mL 于92 ℃冷凝回流提取2 h，减压抽滤，滤液定容于200 mL，浓度以火棘干物质质量计为100 g/L，离心，收集上清液0～4 ℃冷藏备用。

1.2.2 火棘多酚的测定

取1.2.1 中稀释100 倍后的火棘多酚提取液1 mL，加入0.4 mol/L 福林酚试剂5 mL，混匀后，再加入170 g/L 的Na2CO3溶液1 mL，补充双蒸水至总体积为10 mL，混匀(后续试验均依照此体系执行)，于25 ℃避光恒温水浴反应1 h，冰水冷却，室温条件下于765 nm 波长处测定吸光度。

1.2.3 最大吸收波长的确定

取适宜浓度的火棘多酚提取液及没食子酸标准品溶液各1 mL，参照1.2.2 显色反应后，室温条件下于200～900 nm 全波段扫描，以确定最大吸收波长。

1.2.4 反应体系的确定

以10 μg/mL 没食子酸标准品溶液1.0 mL 作为研究对象，确定福林酚法检测总酚含量的最佳反应体系。分别考察了福林酚试剂的浓度(mol/L)及用量(mL)、Na2CO3溶液的浓度(g/L)及用量(mL)、水浴时间(min)及温度(℃)对总酚含量测定的影响以及火棘总酚溶液体系pH 值及火棘总酚提取液中乙醇体积浓度(%)等因素对火棘总酚含量测定的影响。

影响火棘多酚含量测定的单因素考察

1.2.5 影响火棘多酚含量测定的单因素考察

在1.2.4 的基础上，确定多酚检测的反应体系为V待测溶液∶V福林酚试剂∶V碳酸钠溶液=1∶5∶1，以此反应体积比为模板，继续深入探讨福林酚试剂及Na2CO3溶液的浓度、水浴时间及温度、火棘总酚溶液体系pH 值及火棘总酚提取液中乙醇体积浓度对火棘多酚测定的具体影响。

1.2.6 响应面优化实验

在1.2.5 项的基础上，以吸光度为评价指标，固定待测溶液及反应体系，确定福林酚的浓度为0.4 mol/L，选择对火棘多酚检测影响显著的3 个因素:水浴时间、水浴温度及Na2CO3溶液的浓度，按照Box-Behnken 设计，具体见表1。

表1 Box-Behnken 设计因素水平及编码值Table 1 Levels and factors of response surface tests

1.2.7 方法学验证

经过响应面优化得到火棘多酚含量检测的最优条件后，我们确定了没食子酸的标准曲线及火棘多酚的工作曲线，并进行重复性、重现性、稳定性、回收率等方法学验证实验。

2 结果与讨论

2.1 最大吸收波长的确定

参照1.2.3 设计，结果表明火棘多酚提取液及没食子酸标准品溶液均在765 nm 处达到最大吸收，故可选765 nm 作为最大检测波长。

2.2 反应体系的确定

参照1.2.4 设计，结果分别见图1(A～E)。

图1 福林酚试剂的用量(A)及浓度(B)、Na2CO3溶液的用量(C)及浓度(D)、水浴时间及温度(E)对火棘总酚含量测定的影响Fig.1 Effects of amount (A)and concentration (B)of Folin-Ciocalteu reagent，amount (C)and concentration (D)of Na2CO3，Incubation time and temperature (E)on total polyphenols of P.fortuneana

由图1(A)可知，随着福林酚用量的增加，吸光度逐渐增加，至福林酚体积5 mL 时达到最大，此后趋于平缓，因此，福林酚添加量选为5 mL。由图1(B)可知，福林酚浓度增加时，吸光度逐渐升高，当浓度超过0.2 mol/L 时增幅趋缓，故选择福林酚浓度为0.2 mol/L 继续研究。由图1(C)及图1(D)可知，随着Na2CO3溶液体积及浓度的增加，吸光度先快速增加后趋于平缓，添加量为1.0 mL，浓度为150 g/ L 时达到最大，因此Na2CO3溶液添加量选为1.0 mL，浓度为150 g/ L。由图1(E)可知，随着水浴温度的增加，吸光度先增后减，25 ℃时，达到最大值，当温度继续增加时，体系稳定性下降;随着水浴时间的延长，吸光度增幅缓慢，选水浴时间30～60 min较为合适。

2.3 影响火棘多酚含量测定的单因素考察

参照1.2.5 设计，结果见图2(A～E)。

参照2.2 的分析，结合图2(A～C)可知，在用于火棘多酚检测时，福林酚浓度可调整至0.4 mol/L，Na2CO3溶液浓度可选择200 g/L，水浴温度选择25 ℃，水浴时间60 min 较为合适。由图2(D)可知，溶液体系的pH 对总酚含量的测定有一定影响，当pH＜3 时，无显著影响，3＜pH＜5 时，随pH 增加，吸光度增加，5＜pH＜7 时，随pH 增加，吸光度减小。考虑到火棘酚类溶液呈酸性，在酸性条件下贮藏稳定，因此只考察酸性条件对检测的影响。工业化生产时，多酚的提取免不了使用乙醇为溶剂，由图2(E)可知，待检体系中乙醇的含量对多酚检测有一定影响，随着乙醇浓度的增加，吸光度先增后减，乙醇浓度为40 %时达到极值，进一步增大乙醇浓度超过80 %时，待检溶液出现浑浊，分析认为是提取液中少量多糖醇沉析出或Na2CO3难溶入乙醇而析出。

图2 福林酚试剂的浓度(A)、Na2CO3溶液的浓度(B)、水浴时间及温度(C)、火棘总酚溶液体系pH 值(D)及火棘总酚提取液中乙醇体积浓度(E)对火棘总酚含量测定的影响.Fig.2 Effects of concentration of Folin-Ciocalteu reagent (A)，concentration of Na2CO3(B)，incubation time and temperature(C)，pH of total polyphenols solution from P.fortuneanna (D)and ethanol concentration of extraction solution from P.fortuneana (E)on total polyphenols of P.fortuneana

2.4 响应面优化实验

按照1.2.6 设计，具体结果参见表2。

表2 Box-Behnken 实验设计及结果Table 2 Box-Benhnken experimental design and the results

利用Design-Expert 8.0.6 软件，对表2 结果进行统计分析，得到三元二次回归方程式:Y=0.30 +0.087 X1+5.25 ×10-3X2+0.013 X3-0.01 X1X2-9.5×10-3X1X3-4.75 ×10-3X2X3-0.07-7.9 ×10-53-9.65 ×10-3利用Design-Expert 8.0.6 软件，进一步对实验结果进行统计分析，结果见表3。

表3 方差分析表Table 3 ANOVA of regression analysis

由表3 可知，X1、X3、项对响应值影响极显著(P＜0.01)，X1X2项影响显著(0.01＜P＜0.05)。判定系数R2=0.9941 说明模型显著，相关性非常好，实验因素对响应值有较大影响。校正判定系数=0.9865，表明98.65%的实验数据的变异性可以用此回归模型解释。变异系数CV=3.26%，说明实验的可信度及精确度较好。精确度＞4 视为合理，本实验精密度=31.256，表明符合要求。模型F值为131.30，表明该模型达到极显著水平(P＜0.01)。此外，失拟项F 值为4.24(P=0.0985 ＞0.05)，说明失拟值和纯误差没有显著性关系，回归模型在被研究的整个回归区域不失拟，该模型能用于指导实验。

进一步对模型进行两因素效应分析，结果见图3。

由图3(A)可知，Na2CO3浓度与水浴时间交互作用显著，吸光度随Na2CO3浓度的增加呈现先快增后减缓的趋势，在Na2CO3浓度为145 g/L 左右时达到极值，Na2CO3浓度对吸光度影响显著。图3(B)表明水浴时间与水浴温度交互作用不显著，相对而言，水浴温度对吸光度的影响更显著一些。图3(C)表明，吸光度随Na2CO3浓度的增加呈现先快增后减缓的趋势，在Na2CO3浓度为160 g/L 左右时达到极值，相对而言，Na2CO3浓度对吸光度影响更显著。

通过软件(Design Expert 8.0.6)分析得到火棘多酚检测的最适条件为Na2CO3浓度171 g/L、水浴时间40.43 min，水浴温度33.97 ℃，在此条件下吸光度的预测值为0.3306。为了验证该响应面结果的可行性，对所得最佳条件进行了优化和验证实验。在Na2CO3浓度170 g/L、水浴时间40 min，水浴温度34 ℃条件下进行5 次实验，所得吸光度分别为0.3253、0.3263、0.3243、0.3260、0.334，平均值为0.3277，相对标准偏差为0.495%，说明该条件下实验结果稳定，与预测值的相对误差为1.51%，说明该响应面结果可靠。

2.5 测定方法评价

2.5.1 标准曲线关系考察

图3 火棘多酚含量测定响应面及等高线图Fig.3 Response surface plots and contour plots for the determination of polyphenols content from P.fortuneana

配制不同浓度(10、15、20、25、30、35 μg/mL)的没食子酸溶液及火棘总酚提取液(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L)，按以上试验得出的最适条件显色后，在765 nm 波长测吸光度，分别以没食子酸及火棘总酚提取液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标进行线性回归，分别得到线性回归方程为:Y=0.00111+0.01682X(R2=0.9983)，Y=0.04482+0.32057xX(R2=0.9965)。结果表明没食子酸及火棘总酚提取液浓度分别在10～35 μg/mL 以及0.4～1.4 g/L 与吸光度线性关系良好。其中y 为吸光度，x 为浓度。

2.5.2 重复性考察

按已确定的最适条件，取火棘总酚浓度为0.4、1.4 g/L 样品2 份，由同一分析人员在765 nm 波长处平行测定5 次吸光度，记录数据，求相对标准偏差RSD(%)，结果见表4。

表4 重复性实验Table 4 Repeatability tests of the determination results

表5 重现性实验Table 5 Reproducibility tests of the determination results

由表4 可知，该方法测定2 份样品的标准偏差分别为0.00158 和0.00235，相对标准偏差为0.90%和0.47%，呈现出良好的重复性。

2.5.3 重现性考察

按已确定的最适条件，取火棘总酚浓度为0.4、1.4 g/L 样品2 份，由不同实验室，不同分析人员在765 nm 波长处平行测定5 次吸光度，记录数据，求相对标准偏差RSD(%)，结果见表5。

由表5 可知，该方法测定2 份样品的标准偏差分别为0.00230 和0.00239，相对标准偏差为1.33%和0.48%，呈现出良好的重现性。

2.5.4 稳定性考察

按已确定的最适条件，取火棘总酚浓度为0.4、1.4 g/L 样品2 份，每隔10 min 在765 nm 波长处测定吸光度，连续测定6 次。记录数据，求相对标准偏差RSD(%)，结果见表6。

表6 稳定性实验Table 6 Stability tests of the determination results

由表6 可知，该方法测定2 份样品的标准偏差分别为0.0016 和0.0018，相对标准偏差为0.92%和0.36%，表明样品在1 h 内检测稳定。

2.5.5 加标回收率测定

取5 份浓度为0.4 mg/mL 火棘总酚提取液1.0 mL，分别加入没食子酸0.2 mg，按以上实验确定的最适条件，测定5 份样品的吸光度并计算混合后的总酚含量。计算回收率及相对标准偏差，结果见表7。

表7 没食子酸加样回收率实验(n=5)Table 7 Recovery tests of gallic acid (n=5)

由表7 可知，该方法的相对标准偏差仅为0.12%，具有较高的回收率99.95%。

3 结论

通过响应面优化建立了福林酚比色法检测火棘总酚含量的定量方法。结果表明，火棘总酚的最适检测条件为:1 mL 适宜浓度的火棘总酚提取物，加入0.4 mol/L 福林酚试剂5 mL，漩涡混匀后，加入170 g/L Na2CO3溶液1 mL，混匀后于34 ℃水浴反应40 min，冰水中快速冷却，室温条件下于765 nm波长测吸光度。该方法具有极好的重复性及重现性，1 h 内检测稳定性高，回收率高达99.95%，测定时虽然待测液体系pH 及乙醇浓度对吸光度有一定的影响，但因为待检样品液检测时都被预先稀释了很多倍或通过待检体系得以稀释，因此可忽略待测液体系pH 及乙醇浓度的影响。该方法可推广应用于其它植物总酚含量的检测。

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