林麝AR基因外显子1、4、8的克隆和多态性检测

王永奇，白 康，任战军＊，刘文华，李斐然，黎 勇，朱承嗣，唐 婕，唐青山，王方荣

（1.陕西省动物研究所，陕西 西 安7100321；2.西北农林科技大学 动 物科技学院，陕西 杨 凌712100；3.陕西镇坪逢春林麝养殖有限公司，陕西 镇 坪725600）

我国是麝资源分布最广泛的国家之一，其中，四川与陕西的林麝资源较为丰富。中国境内能分泌麝香的麝现有6种，林麝、马麝、原麝、黑麝、喜马拉雅麝、安徽麝。林麝（Moschus berezovskii）是分布范围最广的品种，体型最小，有4个亚种，分别为指名亚种、越北亚种、云贵亚种、滇北亚种。其中分布于秦岭的林麝属于指名亚种。雄性林麝的鼠蹊部有麝香腺，能分泌麝香。麝香是配制高级香水、高级香料的重要原料，具有极高的经济价值、药用价值和学术研究价值。近代科学研究及临床医学证明麝香对于治疗东亚国家尤其是中国的很多疾病具有一定的药理作用，其药用功效在中国几千年的中医学中被广泛应用。由于人类对森林过度砍伐，林麝栖息地急剧缩小，这无疑对林麝的生存造成巨大威胁，加之人们对麝香的需求不断加大，林麝濒临灭绝或在一些地方已经灭绝。据估计，20世纪60年代末，全国总量超过1百万只。1978-1980年，林麝资源量却不足60万只。1980年以后，由于麝香价格不断攀升，而且人类过度捕获，导致其数量急剧下降，至20世纪90年代末估计已减少至20～30万只，据估计90年代初全国只有10～20万只。由于天然麝香供应量不足，以致我国的中医药和化妆品行业遭受到巨大的打击。因此我国已于2002年将麝从国家二级重点保护动物上调为国家一级重点保护动物。人工养殖是珍稀动物保护重要方式之一，我国20世纪50年代开始人工养麝研究。现已在人工饲养、繁育、取香和疾病防治等方面取得了显著成绩。但是，人工养殖要取得更大成功，必须在基础研究方面有所加强［1-2］。

香囊为公麝独有的器官，其腹侧面有前后两个开口，前面的开口称之为香囊口，可排出香囊内腺体的分泌物［3］。香囊位于腹下部阴囊与脐部之间，呈椭圆形的囊状物，其分泌物的气味能够吸引异性。泌香是雄性林麝的第二性征，与其生殖器官以及雄激素的分泌有着密切的关系［4］。试验证明在切除睾丸以及副睾后，林麝将不再产生生殖反应的，也就不再有泌香反应，不能形成成熟的麝香。当给其注射适量的外源性雄激素（丙酸睾丸酮，脑垂体促黄体素和下丘脑促黄体素释放素等）后，林麝又会出现泌香反应并能生成成熟的麝香，而且利用外源性雄激素诱导生香的技术并不影响雄麝泌香量［5-9］。激素调节林麝泌香的途径如下：丘脑下部→LRH→垂体前叶→LH、FSH→睾丸间质细胞→雄性激素→麝香腺→分泌香液→麝香内转化→麝香［10］。综上所述，雄性激素能诱导林麝泌香。雄性激素受体外显子序列的变化可能会影响其与配体结合，从而可能影响到麝香的质量。

雄激素受体基因是类固醇激素受体家族成员之一。研究发现，人类的雄激素受体基因是在X染色体上（Xq11.2-12），是由8个外显子和7个内含子组成［11］，一般由4个结构域组成：（1）NH2端-转录调节区AF-1（Exon1），可与激活物或阻遏物结合从而对AR进行调控；（2）DNA结合区 DBD（Exon2、Exon3），受体的DBD区可识别并结合靶基因上激素反应元件，从而诱发靶基因的有效转录；（3）铰链区（HR）；（4）配体结合区（LBD）、AF-2，主要决定受体结合配体的特异性。受体N末端氨基酸组成和长度差异较大，然而DNA结合区和配体结合区的序列相对保守。AR基因编码的雄性激素受体（androgen receptor，AR）一种配体依赖型的反式转录调节蛋白，属于核受体超家族成员，与特异的DNA的序列结合，通过介导雄激素的作用可调控多种基因的转录表达［11-15］。而配体结合区是雄激素特异结合的区域，可以介导雄性激素在靶细胞中发挥作用，大量研究结果表明，只有雄激素和雄激素受体结合才能发挥重要的、广泛的生理功能。大量试验证实：AR基因外显子多态性可能在AR活性强弱的平衡中发挥“微调”作用，与人类多种疾病的发生有关联，如男性不育、前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌等［16-17］；与动物生产性能存在相关性，例如猪雄性激素受体多态性对产仔数有影响［18］。除此之外，麝的泌香与雄性生殖器官及其雄激素分泌的相关研究鲜有报道。

本研究拟采用PCR、单链构象多态性技术，研究雄性激素受体基因外显子1、4、8的遗传变异情况，并分析其与泌香量的相关性，探寻其与林麝泌香性能密切相关的遗传标记位点，为选育高产优质麝香的林麝提供理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

50头雄性林麝毛发样品（带毛根）均采自陕西凤县的3个养麝场。毛发来源与文献［13］相同。置于灭菌包装袋中，每个个体记录不同的编号，冷冻保存于-80℃超低温冰箱中。

主要试剂包括2×ES Taq Master Mix（含染料，康为世纪生物科技有限公司）、琼脂糖、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为世纪生物公司出品）、PGE-T试剂盒、10×TBE 、TEM ED、甲叉、丙烯酰胺、APS、二甲苯青FF、溴酚蓝、Na2EDTA·2 H2O、共离子甲酰胺等。

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA的提取 参照文献［19-20］的方法。

1.2.2 引物设计 本试验引物设计参照文献［20］所用的扩增引物，均由上海生工生物技术服务有限公司合成。

表1 引物序列及相关信息Table 1 Primer sequences and related information of AR

表2 PCR扩增体系及其扩增程序Table 2 The PCR amplification systeem and it＇s procedures

1.2.3 PCR扩增 PCR扩增体系和程序按照表2进行，每个样本取4μL PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测扩增效果。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 配置30%的丙烯酰胺溶液制胶，待胶完全凝固后，选取琼脂糖凝胶电泳检测带型单一的PCR产物进行SSCP分型。具体操作如下：每个样本取5μL的PCR扩增产物，与5 μL变性剂（95%甲酰胺、10 mmol／L EDTA、0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯青）混合，瞬时离心后，PCR仪中98℃变性10 min，放置冰中骤冷以防DNA双链复性，放置20 min后，点样。首先250 V预电泳15 min，而后110 V电泳过夜。电泳结束后，将凝胶取出置于超纯水中，漂洗两次后，于1%硝酸银溶液中染色20 min，要求避光轻摇，染色时间可自行调整。然后用2%氢氧化钠和0.1%甲醛配置显色液，要求现用现配，凝胶在显色液中显色，直至呈现出清晰的电泳条带，要避免显色时间过长，最后拍照和分析条带。

图1 林麝基因组DNA琼脂糖凝胶电泳M.DL2000 Marker；1～20.从毛发中提取基因组DNA结果Fig.1 1%Agarose gel electrophoresis of forest musk deer genomic DNA M.DL2000 Marker；1～20.genomic DNA of hair tissue with PCR method

1.2.5 测序 首先利用凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化回收，将提纯的DNA片段与pGEM-T Easy载体相连接（16℃放置8 h）。42℃水浴锅中热击90 s使重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，37℃摇菌使菌体复苏，涂板，37℃培养过夜培养后挑取单菌落扩大培养，最后提取菌液中的质粒送往华大基因测序。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的浓度与纯度检测

用Nanodrop检测DNA浓度和质量。结果显示样本260／280值在1.8～2.0之间，说明提取的DNA质量均良好，可用于后续试验。提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，成像后，结果如图1所示。由图可见条带单一、无拖尾现象，表明从血液中提取的DNA的完整度良好。

2.2 林麝AR基因外显子（1、4、8）琼脂糖凝胶电泳检测

由图2、3、4可知，条带单一，无非特异扩增，表明各样本均获得了理想的PCR产物，可以用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图2 林麝雄性激素受体基因外显子1 PCR扩增结果Fig.2 PCR products of AR Exon 1 of forest musk deer

图3 林麝雄性激素受体基因外显子4 PCR扩增结果Fig.3 PCR products of AR Exon 4 of forest musk deer

图4 林麝雄性激素受体基因外显子8 PCR扩增结果Fig.4 PCR products of AR Exon 8 of forest musk deer

2.3 SSCP分析结果

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如下图，结果显示雄麝AR基因三个外显子都仅有一种带型，表明三个外显子均无多态性。

2.4 测 序

图5 林麝雄性激素受体基因外显子1扩增片段SSCP分析Fig.5 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon1 of forest musk deer

图7 林麝雄性激素受体基因外显子8扩增片段SSCP分析Fig.7 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon8 of forest musk deer

对所有样本的扩增产物进行测序得到外显子1、4、8的序列，进行多序列比对，结果显示，AR基因三个外显子均为单态。

3 讨 论

比较人、牛、羊、大鼠、鸡等AR基因，发现AR基因的外显子序列通常具有共同的结构功能，具有同源性，有较高的保守性，突变概率为1／1000。试验结果似乎说明了AR基因外显子1、4、8在秦岭雄性林麝群中具有一定的保守性。

林麝秦岭种群从外形特征、毛色等性状上一致性较高，变异很小，性状变异视乎很小。但是，种群在繁殖性能、泌香性能上是有明显变异，故在AR基因外显子上没有找到多态性，归因于秦岭林麝种群在AR基因突变可能性较小的，似乎可以说得过去。但是仔细研究过于牵强，也许还有其他原因，比如采样问题、引物设计问题等等。

由于林麝野性强，应激性大，样本采集困难。虽然采集了来自于3个场50个样本，场际距离又很近，但是样本量不足够大，代表性不强，也可能是造成AR基因不具备多态性的重要原因之一。

目前尚未报道麝科动物或者更近源的物种如鹿科的相关基因序列或者引物，引物设计主要参考牛、人、大鼠而得，这可能是造成AR基因不具备多态性的另一重要原因。还需要进一步探索新引物、新基因位点作为研究对象。

图6 林麝雄性激素受体基因外显子4扩增片段SSCP分析Fig.6 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon4 of forest musk deer

因此，在后续探究林麝有关高泌香量的候选基因研究中，一方面仍需对林麝雄激素受体基因的序列全长进行深入分析，另一方面也可以另辟蹊径寻找其他相关候选基因。

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