祛风除湿颗粒的质量标准研究

郑 飞 ，孙敬蒙，张炜煜#(1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117;.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117)

祛风除湿颗粒由鹿衔草、石菖蒲、牛膝、甘草等中药制成的复方制剂，具有通经活络、祛风除湿的功效，用于治疗风湿痹痛，腰膝疼痛。本制剂中，君药为鹿衔草，具有祛风湿、强筋骨的功能，其化学成分为黄酮类、酚苷类、醌类、萜类等，黄酮类成分含量最多，主要为金丝桃苷，2″-O-没食子酰基金丝桃苷，槲皮素［1-4］。为方便患者服用、携带，将祛风除湿颗粒制成颗粒剂，为有效控制复方制剂的质量，本实验采用薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)对石菖蒲、牛膝、甘草进行薄层定性鉴别，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定金丝桃苷的含量，进而制定该制剂的质量标准。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Agilent C18-SB 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);UV-9600 型紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);AR2140 型电子精密天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);电热恒温水浴锅(北京科伟永鑫实验仪器设备厂);SD-1000 型喷雾干燥机(东京理化)。

1.2 药品与试剂

石菖蒲、牛膝、甘草对照药材(中国食品药品检定研究院，批号:120904-201016，ID:ZRUG-OA5Q，0.5 g);金丝桃苷标准品(中国生物制品检定所，批号:111521-201004);甲醇、乙腈均为色谱纯(sigma);硅胶G、GF254 薄层板;甲醇、磷酸均为分析纯(北京化工厂);娃哈哈纯净水(娃哈哈集团有限公司);复方祛风湿颗粒(自制，批号:20140121)。

2 方法与结果

2.1 祛风除湿颗粒的制备

取处方量的鹿衔草、牛膝、石菖蒲，加12 倍于药材量的70%乙醇，回流提取2 次，每次1 h，合并滤液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至密度为1.02 ～1.05(60 ℃测)的浓缩液，备用;醇提后的药渣与甘草加10 倍于药材量的水煎煮2 次，每次1.5 h，滤过，合并水煎液并浓缩至密度为1.02 ～1.05(60 ℃测)的浓缩液，合并醇提和水煎液;采用喷雾干燥技术，进风温度为110 ℃，进料速度为260 ml/h，雾化压力为100 kPa，得喷雾干燥粉末，备用;称取处方量提取物干燥粉末及辅料，过筛混合，加入适量乙醇制软材，14 目标准筛制粒，50 ℃～60 ℃干燥，12 目筛整粒，即得。

2.2 性状

对多批样品进行颜色、气、味综合观察。确定本品为棕色颗粒;气香，味微苦。

2.3 定性鉴别

2.3.1 石菖蒲:取本品3 批(批号:20140113、20140119、20140126)，每批2 g，研细，分别加石油醚(60 ～90 ℃)20 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加石油醚(60 ～90 ℃)2 ml使溶解，作为供试品溶液。另取石菖蒲对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再按处方比例另取缺石菖蒲以外的药材按制备工艺制得阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法［《中华人民共和国药典:一部》(2010年版)附录ⅥB］试验，吸取上述3 种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚(60 ～90 ℃)-乙酸乙酯(V ∶V=4 ∶1)作为展开剂［5-7］，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视，见图1。结果表明，供试品在与对照药材色谱相对应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。

图1 石菖蒲的TLC 图Fig 1 TLC of A．tatarinowii

2.3.2 牛 膝:取 本 品3 批(批 号:20140113、20140119、20140126)，每批2 g，研细，分别加乙醇20 ml 回流提取40 min，滤过，滤液加入盐酸2 ml 回流提取1 h 后浓缩至约5 ml，加水10 ml，用石油醚(60 ～90 ℃)提取2 次，每次20 ml，合并石油醚液，蒸干，残渣加乙醇2 ml 使溶解，作为供试品溶液。另取牛膝对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。再按处方比例另取缺牛膝以外的药材按制备工艺制得阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法［《中华人民共和国药典:一部》(2010 年版)附录ⅥB］试验，分别吸取上述溶液各10 μl，点于同一硅胶G 薄层板上，以氯仿-甲醇(V∶V=10∶1)作为展开剂［8-9］，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。见图2。结果表明，供试品在与对照药材色谱相对应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。2.3.3 甘 草:取 本 品3 批(批 号:20140113、20140119、20140126)，每批2 g，研细，分别加甲醇40 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 ml 使溶解，用水饱和正丁醇萃取2 次，每次20 ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水溶液20 ml洗涤1 次，弃去水液，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇10 ml 使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材，同法制成对照药材溶液。再按处方比例另取缺甘草以外的药材，按制备工艺制得阴性颗粒，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法［《中华人民共和国药典:一部》(2010 年版)附录ⅥB］试验，吸取上述溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(V ∶V ∶V ∶V=15 ∶1 ∶1 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365 nm)下检视［10-11］，见图3。结果表明，供试品在与对照药材色谱对应位置上显相同颜色斑点，阴性无干扰。

图2 牛膝的TLC 图Fig 2 TLC of A．bidentata blume

图3 甘草的TLC 图Fig 3 TLC of G．uralensis fisch

2.4 检查

2.4.1 粒度:照粒度测定法［《中华人民共和国药典:一部》(2010 年版)附录ⅪB 第二法，双筛分法］进行测定。分别取3批(批号:20140113、0140119、20140126，下同)自制样品30 g，称定质量，置1 号筛和5 号筛中，保持水平状态过筛，左右往返，边筛动边轻叩3 min。取不能通过一号筛和能通过5 号筛的颗粒及粉末，称定质量，计算所占百分比。结果表明，3 批自制样品不能通过1 号筛和能通过5 号筛的颗粒及粉末所占比例分别为10.6%，9.3%和11.2%，均＜15%，符合规定。

2.4.2 水分:照水分测定法［《中华人民共和国药典:一部》(2010 年版)附录ⅨH］进行测定。分别取3 批自制样品5 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，疏松供试品不超过10 mm，精密称定，打开瓶盖在100 ～105 ℃干燥5 h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30 min，精密称定，再在上述温度干燥1 h，冷却，称定质量，至连续2 次称定质量的差异不超过5 mg 为止［12］。根据减失的质量，计算供试品中含水量(%)。结果表明，3 批自制样品的含水量分别为3.9%，4.2%和4.9%，均小于6.0%，符合规定。2.4.3 溶化性:取上述3 个批号的自制样品各1 袋，分别加热水200 ml，搅拌5 min，立即观察［13］。结果表明，3 批自制样品倒入水中搅拌5 min，溶液呈混悬状，且混悬均匀，符合规定。2.4.4 装量差异:照《中华人民共和国药典:一部》(2010 年版)附录IC“颗粒剂制剂通则”项下要求，对3 批样品的装量差异进行检查。取上述3 个批号的自制样品各10 袋，分别称定每袋内容物的质量，每袋装量与标示量相比较。结果表明，3 批自制样品每袋的质量均未超过标示装量(5 ±5 ×7%)g，符合规定，见表1。

表1 装量差异检查结果Tab 1 Results of the gross deviation

2.5 金丝桃苷的含量测定

2.5.1 标准品溶液的制备:取金丝桃苷的标准品约5 mg，精密称定，置25 ml 量瓶中，加甲醇适量，振摇使其溶解，加甲醇稀释至刻度，滤过，即得。

2.5.2 供试品溶液的制备:取自制颗粒5 g，精密称定，研细，置100 ml 烧杯中，加甲醇50 ml，超声30 min，放冷，滤过，取续滤液5 ml，于60 ℃水浴上挥干，残渣加甲醇溶解，转移至25 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液［14］，即得。

2.5.3 最大吸收波长的确定:取金丝桃苷对照品溶液0.5 ml，置5 ml 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按紫外-可见分光光度法［《中华人民共和国药典:一部》(2010 年版)附录ⅤA］以相应试剂为空白，在200 ～800 nm 波长范围内进行扫描，扫描结果见图4。结果表明，对照品溶液分别在257、361 nm 波长处有最大吸收峰，《中华人民共和国药典》(2010 年版)规定的检测波长为360 nm，综合扫描结果，确定测定波长为360 nm。

图4 金丝桃苷对照品的光谱扫描图Fig 4 Spectral scans of hyperoside reference substance

2.5.4 色谱条件:Agilent C18-SB 色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);紫外检测器;流动相乙腈-0.1% 磷酸溶液(V ∶V =18 ∶82);柱温25 ℃;流速1 ml/min;检测波长360 nm［15］。2.5.5 系统适用性实验:在本色谱条件下，供试品溶液中金丝桃苷得到较好的分离，其色谱峰的保留时间与对照品一致，见图5。

图5 金丝桃苷HPLC 图Fig 5 HPLC chromatograms of hyperoside

2.5.6 方法学考察:(1)线性关系考察:分别精密量取金丝桃苷对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 ml，置2 ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，作为不同浓度对照品溶液;分别将不同浓度对照品溶液进样10 μl 测定，记录峰面积，以对照品浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得回归方程为Y=14 376X+130.44，r=0.999 6，金丝桃苷在0.01 ～0.20 mg/ml 浓度范围内线性关系良好。(2)中间精密度试验:中间精密度为在同一个实验室，不同时间由不同分析人员使用不同分析设备测定结果之间的精密度。分别取2 批平行样品3 份，按“2.5.2”项下制备供试品溶液，依法进行含量测定，结果RSD为1.81%，表明仪器精密度良好。(3)重复性试验:在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度。取同一批样品6 份，按“2.5.2”项下制备供试品溶液，依法进行含量测定，结果RSD为1.95%，表明样品重复性良好。(4)稳定性试验:在本试验条件下，取供试品溶液分别在室温放置0、2、4、6、8、12 h，依法进行含量测定，结果RSD为1.83%，表明供试品溶液至少在12 h 内稳定。(5)回收率试验:精密吸取已知含量的供试品溶液6 份，分别精密加入0.020 0 mg 金丝桃苷对照品溶液，按“2.5.2”项下制备供试品溶液，依法进行含量测定，结果平均回收率为100.95%(n=6)，表明此方法可行。

2.6 样品含量测定

分别取3 批样品适量，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，测定金丝桃苷的含量，结果见表2。根据上述测定结果，3 批样品金丝桃苷平均含量为42. 54mg/袋。根据生产实际，在平均含量的基础上分别下调20%制定本制剂含量限度［16］，即本品每袋(5 g)中含金丝桃苷不得少于34 mg/袋。

表2 祛风除湿颗粒中金丝桃苷含量测定(n=3)Tab 2 Content determination of hyperoside in Qufengchushi Granules(n=3)

3 讨论

在甘草的定性鉴别试验中，按《中华人民共和国药典:一部》(2010 年版)“甘草”项下鉴别方法操作，供试品的处理相对复杂。参考文献，并经过反复试验，确定供试品的处理方法先加甲醇超声提取，再水饱和正丁醇萃取，并调整了各相展开剂比例，得到了斑点清晰、分离度较好的TLC 色谱图。

金丝桃苷为黄酮醇苷类化合物，在260 ～360 nm 下有最大吸收，本试验选择360 nm 为检测波长，以尽可能地排除提取物中其他杂质的干扰，考察流动相的不同比例，最终得到的金丝桃苷色谱峰与其他杂质峰分离度良好。该法测定结果稳定可靠，且重现性好，为制剂的质量控制提供了依据。

本试验主要对祛风除湿颗粒中的石菖蒲、牛膝和甘草进行了定性鉴别，并对制剂样品中金丝桃苷的含量进行了测定，结果表明所建立的分析方法简便可行、重复性好，可列入该制剂的质量标准中。

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