油茶饼粕蛋白的制备及其酶解物活性分析

王 超 ，仲山民 ，朱俊朋 ，罗 凡 ，常银子，郑 剑 ，郑旭卫

（1. 浙江农林大学 a.农业与食品科学学院；b.浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江 临安 311300；2.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400；3.浙江金华金山油脂有限公司，浙江 金华 321017）

油茶饼粕蛋白的制备及其酶解物活性分析

王 超1a,1b，仲山民1a,1b，朱俊朋1a,1b，罗 凡2，常银子1a,1b，郑 剑1a,1b，郑旭卫3

（1. 浙江农林大学 a.农业与食品科学学院；b.浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江 临安 311300；2.中国林业科学研究院 亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400；3.浙江金华金山油脂有限公司，浙江 金华 321017）

为从油茶饼粕中提取蛋白，采用单因素实验和正交实验方法，研究了油茶饼粕蛋白碱提的重要影响因子，得到的最优制备条件为：起始pH值为10，温度为50 ℃，料液比为1∶14，时间为60 min；在此碱提条件下，油茶饼粕蛋白的溶出率为47.9%。文中还就其酶解物对·OH的清除率的影响情况进行了实验，结果得到的最佳水解条件为：起始pH值为10，酶解温度为40 ℃，酶用量为1.0%、酶解时间为120 min；在此酶解条件下，酶解物对·OH的清除率达到38.9%。文中还对油茶饼粕蛋白活性肽的功能进行了分析，结果表明：当其浓度为150 μg/mL时，其对·OH和DPPH的清除率分别为34.49%和37.73%。

油茶饼粕蛋白；提取；酶解；活性

生物活性肽是有特定生理作用的多功能化合物的总称[1]。这些多肽小的仅由2个氨基酸构成，大的有复杂的长链或环状多肽，常经糖苷化、磷酸化或酰化衍生修饰[2]。

有关研究者[3-4]发现，人类摄食蛋白质，经消化道的酶作用后，大多是以小肽的形式消化吸收的，而以游离氨基酸形式吸收的比例很小[5]。生物活性肽结构复杂，由多种氨基酸组成，这直接导致其种类繁多，分布广泛；其诸多生物活性（如降血压、降低胆固醇、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强机体免疫力、抗氧化等功能）已引起了学者的关注[6]。

油茶饼粕蛋白是一种优良的蛋白质资源。有关分析结果表明，油茶仁果中含有10%～15%的蛋白质，采用冷榨工艺代替传统的高温焙烤再制油工艺，不但能提高油脂的品质，还可以较好地保护其蛋白的活性[7]。

蛋白质的提取方法已有多种，如水相法、水相酶解法、丙醇等有机溶剂提取法等种[8-9]。本研究采用碱提方法，以油茶饼粕蛋白的溶出率为指标，对其提取条件进行了优化，确定了得率最高的制备方案；制备获得的蛋白，再经酶的有限水解，以羟基自由基清除率为考察指标，优化酶解条件；还对所获得的酶解物进行了活性检测，以期为分析其功能与结构特点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 油茶饼粕

供试的油茶饼粕为经低温冷榨工艺制备山茶油后的饼粕。

1.2 试 剂

所用试剂为碱性蛋白酶等试剂。

1.3 仪 器

FZ102型植物粉碎机，天津市泰斯特有限公司；TDL-5-A低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.4 样品处理

油茶饼粕蛋白提取的工艺流程：油茶饼粕→粉碎→50 ℃温水浸泡20 min除杂→更换浸泡液（去除水溶性的多糖、碱类等）→加碱→过滤→滤液中加酸调节至pH＝4.0→获得沉淀物→离心→水洗沉淀至pH＝7→离心→将沉淀冷冻干燥备用。

酶解流程：提取所获蛋白→加适量水溶解→调节pH 加蛋白酶→控制条件反应→灭酶→离心→上清液测·OH清除率。

1.5 碱提油茶饼粕蛋白的条件研究

（1）初始pH值对碱提效果的影响的实验：在料液比为1∶10、温度为50 ℃、提取时间为50 min的条件下连续提取，在初始pH值分别为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0时测定蛋白质的溶出率。

（2）温度对碱提效果的影响的实验：在起始pH值为10、料液比1∶10、提取时间50 min的条件下连续提取，在提取温度分别为20、30、40、50、60 ℃时测定蛋白质的溶出率。

（3）料液比对碱提效果的影响的实验：在起始pH值为10、温度为50 ℃、提取时间为50 min的条件下连续提取，在料液比分别为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14时测定蛋白质的溶出率。

（4）浸提时间对碱提效果的影响的实验：在起始pH值为10、浸提温度为50 ℃、料液比为1∶10的条件下连续提取，在浸提时间分别为20、40、60、80、100 min时测定蛋白质的溶出率。

（5）正交实验的因素与水平：根据以上单因素实验的结果，用反应的起始pH值（A）、浸提温度（B）、料液比（C）、浸提时间（D）作为实验因素，以蛋白质溶出率为考察指标，对油茶饼粕蛋白碱提的参数进行了L9(43)的优化实验，正交实验的因素与水平见表1。

表 1 正交实验的因素与水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.6 碱性蛋白酶水解油茶饼粕蛋白的条件研究

（1）起始pH值对水解油茶饼粕蛋白效果的影响的实验：在酶解温度为40 ℃、酶用量为0.9%、酶解时间为120 min的条件下连续酶解，在起始pH值分别为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0时测定酶解物对·OH的清除率。

（2）酶解温度对水解油茶饼粕蛋白效果的影响的实验：在起始pH值为10、酶用量为0.9%、酶解时间为120 min的条件下连续酶解，在酶解温度分别20、30、40、50、60 ℃时测定酶解物对·OH的清除率。

（3）酶用量对水解油茶饼粕蛋白效果的影响的实验：在起始pH值为10、酶解温度为40 ℃、酶解时间为120 min的条件下连续酶解，在酶用量分别0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%时测定酶解物对·OH的清除率。

（4）酶解时间对水解油茶饼粕蛋白效果的影响的实验：在起始pH值为10、酶解温度为40 ℃、酶用量为0.9%的条件下连续酶解，在酶解时间分别为30、60、90、120、150 min时测定酶解物对·OH的清除率。

（5）正交实验的因素与水平：在以上单因素研究的基础上，用起始pH值（a）、酶解温度（b）、酶用量（c）、酶解时间（d）作为实验因素进行L9(43)的正交优化实验，实验因素与水平见表2。

表 2 正交实验的因素与水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.7 酶解物对羟基自由基清除率的测定

参照文献[10]中的有关方法测定酶解物对羟基自由基的清除率。

2 结果与分析

2.1 碱提油茶饼粕蛋白的实验结果

2.1.1 起始pH值对油茶饼粕蛋白溶出率的影响

起始pH值对油茶饼粕蛋白溶出率的影响的实验结果如图1所示。由图1可知，随着pH值的升高，蛋白质的溶出率逐渐升高。当pH值为7时，油茶饼粕蛋白的溶出率为7.3%；当pH值为9时，油茶饼粕蛋白的溶出率为44.1%；而当pH值为11时，油茶饼粕蛋白的溶出率为47.3%。当pH值为7～9时，油茶饼粕蛋白的溶出率随着pH值的增大而明显上升；而当pH值为9～11时，油茶饼粕蛋白的溶出率趋于稳定。但当pH值较大时，提取液呈深褐色，同时其品质与功能都会遭到破坏。综合分析可知，油茶饼粕蛋白的浸提溶液的pH值宜为8～10。

2.1.2 浸提时间对油茶饼粕蛋白溶出率的影响

浸提时间对油茶饼粕蛋白溶出率的影响的实验结果如图2所示。由图2可知，随着浸提时间的增加，油茶饼粕蛋白的溶出率随之提高，最后趋于稳定。当浸提时间为20 min时，油茶饼粕蛋白的溶出率为3.7%；当浸提时间为60 min时，其蛋白溶出率为43.2%；而当浸提时间为100 min时，其蛋白溶出率为46.9%。实验结果表明，浸提时间为20～60 min时，其蛋白溶出率逐渐提高；之后，油茶饼粕蛋白的溶出率趋于稳定。因此，浸提时间宜控制在50～70 min内。

图1 pH值对油茶饼粕蛋白溶出率的影响Fig. 1 Effect of pH value on soluble rate of C. oleifera dregs proteins

图2 酶解时间对油茶饼粕蛋白溶出率的影响Fig. 2 Effect of enzymolysis time on soluble rate ofC. oleifera dregs proteins

2.1.3 浸提温度对油茶饼粕蛋白溶出率的影响

浸提温度对油茶饼粕蛋白溶出率的影响的实验结果如图3所示。由图3可知，油茶饼粕蛋白的溶出率随着浸提温度的升高而提高，直到浸提温度在50 ℃左右时才开始急剧下降。当浸提温度为20 ℃时，油茶饼粕蛋白的溶出率为33.7%；而当浸提温度为50 ℃时，其蛋白溶出率提高到46.3%。这是因为，蛋白质的溶解度随着温度的升高而升高，同时，溶液的粘度也有所下降，从而加快了化学反应，提高了浸提的速度。但当浸提温度为60 ℃时，油茶饼粕蛋白的溶出率反而降到42.3%。这是因为，当浸提温度在60 ℃时，油茶饼粕蛋白质已变性。综合考虑得出，油茶饼粕蛋白的浸提温度宜控制在40～50 ℃之间。

图 3 酶解温度对油茶饼粕蛋白溶出率的影响Fig. 3 Effect of enzymolysis temperature on solution rate of C. oleifera dregs proteins

2.1.4 料液比对油茶饼粕蛋白溶出率的影响

料液比对油茶饼粕蛋白溶出率的影响的实验结果如图4所示。由图4可知，随着料液比的升高，油茶饼粕蛋白的溶出率明显上升。当料液比为1∶6时，油茶饼粕蛋白的溶出率为20.3%；当料液比为1∶10时，其蛋白溶出率为45.1%。这是因为，当料液比增大时，溶液的粘度随之相对降低，溶液内部的阻力也就减小，分子扩散加快，其浸出速度也就加快。而当料液比为1∶14时，油茶饼粕蛋白的溶出率为47.5%，相对于料液比为1∶10时的油茶饼粕蛋白溶出率而言仅提高2.4%，提高幅度并不大。这是因为，蛋白质溶解于浸提液中已接近饱和状态，过量的蛋白质并不能溶解。因此，料液比宜设在1∶10～1∶14之间。

图4 料液比对油茶饼粕蛋白溶出率的影响Fig. 4 Effect of ratio of material to liquid on soluble rate of C. oleifera dregs proteins

2.1.5 碱提油茶饼粕蛋白的正交实验结果

根据以上碱提油茶饼粕蛋白的各单因素实验结果确定的正交实验设计与实验结果如表3。从表3中可以看出，各因素对碱提油茶饼粕蛋白溶出率影响的主次顺序为A＞B＞C＞D，即起始pH值＞浸提温度＞料液比＞浸提时间；碱提油茶饼粕蛋白的最优组合条件为A3B3C3D2，即起始pH值为10、浸提温度为50 ℃、料液比为1∶14、时间为60 min。因为表3中由极差分析得到的最优组合未出现于此前的9个实验方案中，故需进行验证实验，验证结果表明，在此组合条件下，油茶饼粕蛋白的溶出率可达47.9%，由此证明，该组合条件为最优组合条件。

表 3 正交实验设计及实验结果Table 3 Design and results of the orthogonal experiment

2.2 碱性蛋白酶水解油茶饼粕蛋白的实验结果

2.2.1 起始pH值对·OH清除率的影响

起始pH值对·OH清除率的影响的实验结果如图5所示。由图5可知，随着起始pH值的增大，酶解物对·OH的清除率先呈现出明显的上升趋势，然后急剧下降。当pH值为9.0时，其对·OH的清除率为6.4%；当pH值为10.0时，其对·OH的清除率达到38.2%；而当pH值为11.0时，其对·OH的清除率反而降到5.3%。这是因为，酶分子的活性部位由结合部位与催化部位组成，酶分子中的活化中心内的基团对pH值比较敏感，不同的pH值，活化中心的催化效果不同；由酶分子形成的空间构象是活化中心存在的前提，酶的催化能力与底物构象有关，底物构象有一定的pH环境要求，因此，要发挥最佳的催化功能，需要选取合适的pH值。实验结果说明，pH值的适宜范围为 9.5～ 10.5。

图 5 pH值对·OH清除率的影响Fig. 5 Effect of pH value on ·OH scavenging rate

2.2.2 酶解温度对·OH清除率的影响

酶解温度对·OH清除率的影响的实验结果如图6所示。由图6可知，随着酶解温度的升高，酶解物对·OH的清除率先呈上升趋势，然后相对急剧下降。当酶解温度为20 ℃时，其对·OH的清除率为35.9%；当酶解温度为40 ℃时，其对·OH的清除率达到38.9%；而当酶解温度达60 ℃时，其对·OH的清除率反而降到35.2%。这是因为，适宜的温度能增加酶的活性，加快分子运动，从而加快水解速度，但如果温度过高，则会导致酶蛋白变性、失活。所以，选用的酶解温度范围宜为35～45 ℃。

图6 酶解温度对·OH清除率的影响Fig. 6 Effect of temperature on ·OH scavenging rate

图7 酶用量对·OH清除率的影响Fig. 7 Effect of enzyme dosage on ·OH scavenging rate

2.2.3 酶用量对·OH清除率的影响

酶用量对·OH清除率的影响的实验结果如图7所示。由图7可知，随着酶用量的增加，酶解物对·OH的清除率逐渐升高而后趋于稳定。当酶用量为0.3%时，酶解物对·OH的清除率为29.8%；当酶用量为0.9%时，其对·OH的清除率达到38.4%；而当酶用量达到1.1%时，其对·OH的清除率（38.8%）上升不明显。这是因为，随着酶用量的增加，水解液中的酶浓度也有所增加，使得水解程度加深，当所用的蛋白酶达到一定量时，蛋白完全被水解，所以，此时即使再增加酶的用量，也不能提高其对·OH的清除率。因此，实验选用的酶用量在0.8%～1.0%之间。

2.2.4 酶解时间对·OH清除率的影响

酶解时间对·OH清除率的影响的实验结果如图8所示。由图8可知，酶解物对·OH的清除率随着酶解时间的增加先上升，当酶解时间达到120 min时便开始下降。当酶解时间为30 min时，酶解物对·OH的清除率为21.0%；当酶解时间为120 min时，其对·OH的清除率达到38.2%；但是，当酶解时间增加至150 min时，其对·OH的清除率反而降至34.1%。这是因为，随着酶解时间的增加，酶解反应能够充分地进行，而具有还原能力的蛋白酶解物的含量也随之提高，所以酶解物对·OH的清除率有所提高。但是，当酶解时间过长时，具有强还原能力的肽段水解下来之后又进一步水解了，从而丧失了活性。所以，实验选用的酶解时间为110～130 min。

图 8 酶解时间对·OH清除率的影响Fig. 8 Effect of enzymolysis time on ·OH scavenging rate

2.2.5 碱性蛋白酶水解油茶饼粕蛋白的正交组合优化实验结果

根据以上碱性蛋白酶水解油茶饼粕蛋白的各单个影响因素实验结果确定的正交实验设计与实验结果如表4。从表4中可以看出，各因素对·OH清除率影响的主次顺序为a ＞d＞c＞b，即起始pH值＞酶解时间＞酶用量＞酶解温度；影响·OH清除率的最优组合条件为a2b2c3d2，即起始pH值为10、酶解温度为40 ℃、酶用量为1.0%、酶解时间为120 min。由于由极差分析得到的最优组合未出现于此前的9个实验方案中，故要进行验证实验。在此方案下进行实验，得到的酶解物对·OH的清除率达到38.9%。由此证明，该组合条件为最优组合条件。

表 4 正交实验设计及实验结果Table 4 Design and results of the orthogonal experiment

2.3 油茶饼粕蛋白活性肽的功能分析

2.3.1 油茶饼粕蛋白活性肽对羟自由基（·OH）的清除率

不同浓度的酶解产物对·OH清除率的影响情况如图9所示。由图9可知，油茶饼粕蛋白活性肽对·OH的清除率随着活性肽的质量浓度的变大而显著提高，其对·OH的清除效果与其浓度间存在量效关系。当其浓度为150 μg/mL时，其对·OH的清除率可达34.49%。

图 9 不同浓度的活性肽对·OH的清除率Fig. 9 ·OH scavenging rate under different concentrations of active peptides

2.3.2 油茶饼粕蛋白活性肽对DPPH自由基的清除率

不同浓度的油茶饼粕蛋白活性肽对DPPH自由基的清除率的影响情况如图10所示。由图10可知，油茶饼粕蛋白活性肽对DPPH的清除率随着活性肽质量浓度的加大而提高，其对DPPH的清除率与其浓度间存在量效关系[11]。当活性肽的浓度为150 μg/mL时，其对DPPH的清除率高达37.73%。

图10 不同浓度的活性肽对DPPH的清除率Fig. 10 DPPH scavenging rate under different concentrations of active peptides

3 结论与展望

本实验以冷榨山茶油的饼粕为原料，用碱提工艺制备油茶饼粕蛋白，最优碱提条件为：起始pH值为10，浸提温度为50 ℃，料液比为1∶14，浸提时间为60 min。在此条件下，油茶饼粕蛋白的溶出率为47.9%。

本实验还用碱性蛋白酶酶解油茶饼粕蛋白，得到的最佳酶解条件为：起始pH值为10，酶解温度为40 ℃，酶用量为1.0%，酶解时间为120 min。在此酶解条件下，油茶饼粕蛋白酶解物对·OH的清除率达到38.9%。

实验测定了油茶饼粕蛋白酶解物的抗氧化性，考察了其对羟自由基（·OH）和 DPPH自由基的清除效果。结果表明：油茶饼粕蛋白酶解物具有抗氧化性，其活性与其浓度间呈量效关系。由此可进一步推测：油茶饼粕蛋白的酶解物中含有一些具有抗氧化功能的生物活性肽，这为进一步研究油茶饼粕抗氧化肽的精制与纯化及其一级结构分析积累了基础数据。

蛋白质资源匮乏是世界性研究课题，同时，许多珍贵的动植物蛋白又因技术手段的落后而被浪费；采用非加热、非化学试剂制备植物油脂，从而更好地保护饼粕，这已经得到了学者及业内人士的认可；在这些饼粕中，采用温和的酶水解技术，可以降解蛋白，以利于人和动物的消化吸收，与此同时，也有望获得具有特殊功能的生物活性肽，这对于油料作物资源的综合开发利用、丰富蛋白质来源及保护环境等方面都具有重要意义。

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Preparation and activity of enzymolysis products ofCamellia oleiferadregs proteins

WANG Chao1a,1b, ZHONG Shan-min1a,1b, ZHU Jun-peng1a,1b, LUO Fan2, CHANG Yin-zi1a,1b, ZHENG Jian1a,1b, ZHENG Xu-wei3
(1.a. The Key Laboratory for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province; b.College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A&F university, Lin’an 311300, Zhejiang, China; 2. Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, Zhejiang, China; 3. Zhejiang Jinhua Jinshan Limited Company, Jinhua 321017, Zhejiang, China)

In order to extract proteins fromCamellia oleiferadregs, some important effect factors ofC. oleiferadregs proteins with alkali extraction were researched, by several single factor experiments and an orthogonal experiment, and the optimal extraction processes were obtained, namely initial pH value 10, extraction temperature 50 ℃, solid-liquid ratio 1∶14 and extraction time 60 min. Under these extraction conditions, the extraction rate ofC. oleiferadregs protein reached 47.9%. The effects of enzymolysis products on scavenging rate of ·OH were analyzed, and the optimal enzymolysis conditions were obtained, namely initial pH value 10, enzymolysis temperature 40 ℃, enzyme dosage 1.0% and enzymolysis time 120 min. Under these enzymolysis conditions, the scavenging rate of ·OH reached 38.9%. The functions of protein active peptides fromC. oleiferadregs were analyzed, and the results showed that the scavenging rate of ·OH and DPPH were 34.49% and 37.73% when concentration of protein peptides was 150 μg/mL.

Camellia oleiferadregs proteins; extraction; enzymolysis; activity

S609.9；S794.4；TS22

A

1003—8981(2015)02—0034—07

2014-11-20

浙江省重点科技创新团队项目(2011R50030)；浙江省重大科技专项计划项目(2012C12005-1)；农业科技成果转化资金项目(2013GB24320614)。

王 超，副教授，博士。

仲山民，教授，博士。E-mail：zhongsm2002@zafu.edu.cn

王 超,仲山民,朱俊朋,等. 油茶饼粕蛋白的制备及其酶解物活性分析[J].经济林研究,2015,33(2):34－40.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.006

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文编校：伍敏涛]