加味芎蝎散对咳嗽变异性哮喘大鼠气道重塑及气道平滑肌相关凋亡分子表达的影响*

孙洮玉 王俊宏 徐荣谦

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

·研究报告·

加味芎蝎散对咳嗽变异性哮喘大鼠气道重塑及气道平滑肌相关凋亡分子表达的影响*

孙洮玉 王俊宏 徐荣谦△

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

目的探讨加味芎蝎散对咳嗽变异性哮喘（CVA）大鼠气道重塑的作用及相关凋亡分子表达。方法40只大鼠随机分成对照组、模型组、顺尔宁组、加味芎蝎散组；造模后分组给予相应的药物干预；采用HE观察各组支气管上皮细胞损伤情况、Masson染色法对大鼠支气管厚度，平滑肌厚度及胶原纤维沉积进行检测，免疫组化法检测气道平滑肌凋亡相关分子Bax、Bcl-2、Fas、FasL、Caspase3的表达。结果模型组支气管上皮变性、坏死，支气管厚度增加，胶原纤维沉积明显，气道平滑肌细胞Bax/Bcl-2、Fas、Caspase3表达减少，而顺尔宁组、加味芎蝎散组具有明显升高的作用。结论加味芎蝎散可通过促进气道平滑肌凋亡分子的表达来减轻CVA大鼠的气道重塑作用，从而发挥对于CVA的治疗作用。

气道重塑 气道平滑肌 凋亡 加味芎蝎散 咳嗽变异性哮喘

咳嗽变异性哮喘（CVA）是哮喘的一种特殊类型，以咳嗽为主要或者唯一表现。西医学采用激素为主的治疗方案，并不能根治，且长期应用有一定副作用，而中医药临床疗效确切。本研究在成功制备了CVA模型后，重点对气道各层（主要是气道平滑肌组织）的主要凋亡分子（Bax、Bcl-2、Fas、FasL、Caspase3）表达情况做了研究，同时采用Masson特殊染色，病理图像分析各组气道平滑肌层厚度及胶原纤维含量，以进一步明确以活血祛风法为治则的加味芎蝎散治疗CVA大鼠的作用机制及可能的作用靶点。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量15～22 g，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物中心。

1.2 药物 孟鲁司特钠（顺尔宁），杭州默沙东制药有限公司生产。加味芎蝎散基本方为川芎5 g，全蝎3 g，细辛1 g，荜茇1 g，半夏5 g，白前10 g，五味子10 g，芦根20 g，东直门医院制剂室提供。

1.3 试剂与仪器 卵蛋白VOA（美国Sigma公司），氢氧化铝 （北京化学试剂厂），Fas、FasL、Bcl－2、Bax及Caspase3兔多克隆抗体 （美国Abcam公司）；二抗Pv6001（北京中杉金桥公司）。超声波雾化器（上海鱼跃医疗器械有限公司），RM2125石蜡切片机（德国Leica公司），Olympus bx51显微镜 （日本Olympus公司），IPP6.0（美国Media公司）

1.4 分组及造模 大鼠随机分组为正常对照组、模型组、顺尔宁组、加味芎蝎散组，每组各12只。模型建立参照文献［1］报道，并加以改进：造模动物第1日肌注4%OVA溶液0.5 mL，同时腹腔注射2%Al（OH）30.2 mL，从第14日开始，用1%OVA溶液雾化攻击，隔日1次，共7次。并通过造模后总体外观、病理镜下检测及白细胞、嗜酸粒细胞计数等检测完成。加味芎蝎散组以蒸馏水煎汁后用生理盐水配成相当于生药3.0 g/mL药液，分别按设计剂量灌胃给药 ［剂量为50 g/（kg·d）］。顺尔片组每次给予1.3 mg/kg。正常组每次给予等容积生理盐水，连续27 d。

1.5 标本采集与检测 给药28 d后各组取右下肺固定部位块，一半-80℃冻存，另一半4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE镜下观察，Masson特染，病理图像分析平滑肌和胶原增生；免疫组化检测蛋白的表达情况。

1.5.1 HE染色方法及形态学观察标准 标本固定，石蜡包埋，切片5 μm厚度，苏木素-伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。形态学观察标准见表1。

表1 CVA大鼠气道上皮损伤程度量化标准

1.5.2 Masson染色法 使用北京中杉Masson染色特染试剂盒，镜下观察结果：平滑肌染为红色，胶原纤维染成绿色。分别测量支气管基底膜周径（Pbm，μm），总管壁面积（WAt，μm2），管壁平滑肌面积（WAm，μm2），所有测量值均用Pbm标准化，即WAt/Pbm，WAm/Pbm，分别可代表支气管管壁厚度及相应平滑肌层厚度。

1.5.3 免疫组化染色方法石蜡切片脱蜡至水，枸缘酸缓冲液高压抗原修复，加一抗（各种抗体稀释度均为1∶100），4℃过夜，二抗，DAB显色，镜下观察；水洗，苏木素复染、脱水、透明封片。结果判定，阳性细胞为棕黄色，定位于胞浆。采用Image-pro Plus6.0图像分析软件测定相关蛋白含量，以平均光密度表示。

1.6 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，各组计量数据采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

光镜下HE染色结果如图1所示，模型组上皮细胞变性，脱落，损伤，基底膜不完整。顺尔宁组和加味芎蝎散组均有明显的减轻作用。模型组胶原纤维沉积增加，管壁厚度和平滑肌厚度均较其他各组有明显的增加，而顺尔宁组和加味芎蝎散组亦有明显的减轻作用。见图1、图2、表2、表3。

图1 各组肺组织中Bax表达（SP法，200倍）

图2 各组肺组织中Caspase3表达（SP法，200倍）

3 讨 论

目前认为，气道平滑肌细胞（ASMC）凋亡减低是哮喘气道重塑形成的一个主要机制，如De D［2］发现，气道平滑肌细胞可接受如IL-8、TGF-β等细胞因子的刺激，平滑肌细胞增生，凋亡减少，迁移，从而导致气道重塑。Halwani R等［3］发现趋化因子如eotaxin、RANTES、IL-8以及MIP-1α等可以促进气道平滑肌细胞迁移，抑制细胞凋亡。现已证实，Fas通路（外源性凋亡通路）异常表达是抑制ASMC凋亡的重要原因［4］，bcl-2与bax基因是bcl-2基因家族中最具有代表性的抑制凋亡与促进凋亡的基因［5］。研究发现，在Caspase家族成员中，Caspase3是各种细胞凋亡刺激因子激活的Caspase家族中最关键的蛋白酶，与细胞凋亡最为相关。Caspase3不仅很好的反应细胞凋亡的程度，而且参与细胞凋亡的较晚期阶段［6］。

表2 各组CVA大鼠气道上皮、胶原、平滑肌及管壁厚度结果（μm，±s）

表2 各组CVA大鼠气道上皮、胶原、平滑肌及管壁厚度结果（μm，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，*P＜0.01。下同。

组别 上皮损伤 管壁厚度（W A t / P b m）胶原沉积 平滑肌厚度（W A m / P b m）正常对照组 1 . 0 0 ± 0 . 6 5**9 . 8 0 ± 1 . 2 4**模型组 4 . 0 0 ± 1 . 5 4 1 6 . 4 5 ± 1 . 5 5顺尔宁组 2 . 0 0 ± 1 . 1 8*1 2 . 5 4 ± 1 . 7 2*4 . 8 4 ± 0 . 8 2**3 . 5 2 ± 0 . 5 2**1 5 . 8 4 ± 2 . 8 2 6 . 9 0 ± 0 . 7 7 1 0 . 4 5 ± 1 . 7 2 4 . 4 4 ± 0 . 6 8**加味芎蝎散组2 . 0 0 ± 1 . 5 0*1 3 . 8 8 ± 1 . 8 4*8 . 9 0 ± 1 . 9 4*4 . 8 0 ± 0 . 4 4*

表3 各组肺组织平滑肌免疫组化结果（积分光密度值，±s）

表3 各组肺组织平滑肌免疫组化结果（积分光密度值，±s）

组别 B a x / B c l -2 C a s p a s e 3 F a s F a s L正常对照组 4 3 8 4 . 8 5 ± 4 1 2 . 5 5**2 8 6 5 . 6 3 ± 3 0 8 . 2 0**模型组 1 8 7 6 . 2 5 ± 1 8 7 . 6 3 9 9 5 . 4 2 ± 1 0 8 . 8 0顺尔宁组 2 9 8 6 . 3 6 ± 3 3 5 . 2 5*1 5 6 9 . 2 3 ± 1 4 4 . 5 2**4 0 5 2 . 5 8 ± 4 3 9 . 3 6**2 0 3 4 . 5 5 ± 1 9 4 . 8 5 2 0 3 9 . 3 5 ± 1 8 7 . 2 5 1 8 6 5 . 5 6 ± 1 5 5 . 2 0 3 3 5 8 . 5 2 ± 2 3 1 . 2 0*1 9 8 5 . 5 6 ± 2 2 0 . 2 5加味芎蝎散组2 5 0 8 . 2 3 ± 2 3 7 . 2 5**1 4 9 3 . 5 2 ± 2 1 8 . 2 9**3 6 0 2 . 2 3 ± 2 9 7 . 9 6*2 0 1 2 . 5 2 ± 1 5 6 . 2 0

芎蝎散是宋代陈文中《小儿病源方论》的家传累世之名方，主要用于治疗痰满胸喉、眼珠斜视证，或用于治疗痰气壅塞不能咽药。徐荣谦教授吸收中医儿科先贤使用芎蝎散之宝贵经验，经过多年临床验证，在芎蝎散的基础上加白前10 g，五味子10 g，芦根20 g，形成加味芎蝎散。方中川芎活血行气；全蝎搜风通络以散肺风；细辛、荜茇、半夏温肺化痰；白前温肺降气祛痰；五味子敛肺止咳；芦根清肺止咳。诸药合用，共奏祛风化痰之功。正所谓“治风先治血，血行风自灭；止咳先祛痰，痰祛咳自止”。笔者在2005至2007年对咳嗽变异性患儿的治疗效果进行了病历临床随访观察，证实该方能显著减少患儿咳嗽、有痰、咽痒、咽红等症状［7］。

本次研究采用实验动物在体研究，发现CVA模型组损伤主要涉及上皮变性，平滑肌细胞增生，胶原沉积等，而加味芎蝎散组与顺尔宁组对此3方面均有明显的缓解作用。促凋亡分子Caspase3、Bax、Fas在CVA模型组表达降低，抗凋亡分子Bcl-2亦轻度减低，而加味芎蝎散组与顺尔宁组对促凋亡分子有明显的增强作用。同时也发现，内源性凋亡通路分子FasL在各组均没有明显差异。另外，研究表明，外源性凋亡通路分子中，CAV大鼠气道平滑肌相对于其他各组Fas低表达，而FasL表达率没有差异，这与以往文献报道较一致［8］；在顺尔宁组和加味芎蝎散组中，Fas表达均明显高于模型组。在内源性凋亡（线粒体）通路，笔者研究发现作用拮抗的一对分子Bax和Bcl-2在CVA的ASM中都是减低的，同时Bax/Bcl-2也是降低的，说明是促凋亡和抑制凋亡的因素的共同作用过程，这也进一步解释以前的研究报道中出现不同观点的原因。本实验数据证实模型组Caspase3表达减低，Caspase3的激活减少最终导致平滑肌细胞凋亡减少，迁移增多的发生，而加味芎蝎散组Caspase3明显增加，从而促进平滑肌细胞凋亡。

根据当前研究，初步得出结论：气道平滑肌凋亡减少是CVA大鼠气道重塑的主要病理变化之一，而加味芎蝎散有增加气道平滑肌的凋亡的作用，可能机制是通过调节凋亡分子Caspase3、Bax、Fas的表达。笔者期望下一步能对培养的平滑肌细胞实时观察选定时间点的增殖、凋亡、迁移情况，以进一步分析CVA气道重塑平滑肌发生变化及中药加味芎蝎散的治疗作用相关的分子机制。

［1］ 蔡黎，毕小利，王忆勤，等.咳嗽变异性哮喘豚鼠模型的构建［J］.山西医科大学学报，2007，38（2）：1070-1073.

［2］ De D，RP.The epidermal growth factor receptor and its ligand family：their potential role in repair and remodelling in asthma［J］.Allergy，1999，54（8）：771-783.

［3］ Halwani R1，Al-Abri J.CC and CXC chemokines induce airway smooth muscle proliferation and survival［J］.J Immunol，2011，186（7）：4156-4163.

［4］ Hamann KJ，Vieira JE．Fas cross-linking induces apoptosis in human airway smooth muscle cells［J］.American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology，2000，278（3）：618-624.

［5］ 周兰英，孙圣华，李定梅，等.bcl-2及bax表达与COPD大鼠骨骼肌细胞凋亡的相关性［J］.医学研究杂志，2011，40（8）：104-108.

［6］ Honarpour N，Du C，Richardson JA，et al.Adult Apaf-I-deficient mice exhibit male infertility［J］.Derbiol，2000，218（2）：245-258.

［7］ 伍利芬.加味芎蝎散治疗小儿咳嗽变异性哮喘临床疗效观察［J］.北京中医，2007，26（10）：665-667.

［8］ Druilhe A，Wallaert B.Apoptosis，proliferation，and expression of Bcl-2，Fas，and Fas ligand in bronchial biopsies from asthmatics［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1998，19（5）：747-757.

Effects of Modified Xiongxie San on Airway Remolding in CVA Rats and the Expression of Related Apoptosis Factor

SUN Taoyu，WANG Junhong，XU Rongqian. Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China

Objective：To explore the inhibit effect of Modified Xiongxie San on airway remolding in cough variant asthma（CVA）rats and the expression of related apoptosis factor.Methods：40 rats were randomly and equally divided into 4 groups：control group，CVA groups，Montelukast Sodium group，Modified Xiongxie San group.CVA models were established by sensitization and stimulation with ovalbumin in CVA groups，Montelukast Sodium group，Modified Xiongxie San group.Corresponding measures were given according to the groups.The degeneration and injury of bronchial epithelial cell were measured by HE staining.The airway wall thickness and the bronchial smooth muscle thickness were measured by Masson staining.The expressions of Bax，Bcl-2，FAS，FASL and Caspase3 were detected by immunohistochemical staining.Results：Bronchial epithelial demonstrate degeneration，necrosis，bronchial thickness increased，the collagen fibers deposition in the model group.The expression of Bax/Bcl-2，FAS，Caspase3 of airway smooth muscle cells decreased，while positive drug group relieve group had a significantly improved role.Conclusion：Modified Xiongxie San group may relieve airway remodeling in CVA rats by improving airway smooth muscle apoptosis molecule expression so as to play for cough variant asthma treatment effect.

Airway remodeling；Airway smooth muscle；Apoptosis；Modified Xiongxie San；Cough variant asthma

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0406-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.010

2014-12-16）

北京中医药大学自主选题资助项目（2011JYB22J5-009）

△通信作者（电子邮箱：suntaoyu＠163.com）