活血通脉颗粒对颈动脉粥样硬化家兔ICAM-1、IL-6表达的影响*

谢 健童晓云沈 超李 晓石安华陈文玲刘 涛和春芳王雅莉赵 淳

（1.云南省中医医院，云南中医学院第一附属医院，云南 昆明 650021；2.云南中医学院，云南昆明 650500）

·研究报告·

活血通脉颗粒对颈动脉粥样硬化家兔ICAM-1、IL-6表达的影响*

谢 健1童晓云2沈 超2李 晓1石安华2陈文玲2刘 涛1和春芳1王雅莉1赵 淳1

（1.云南省中医医院，云南中医学院第一附属医院，云南 昆明 650021；2.云南中医学院，云南昆明 650500）

目的探讨活血通脉颗粒干预兔颈动脉粥样硬化（CAS）形成的作用机制。方法75只新西兰白兔，随机抽取10只为正常组，其余65只采用高脂饲料喂养建立CAS模型。造模成功后将其随机分为模型组、自然消退组、活血通脉颗粒低、中、高剂量组、辛伐他汀组6组，每组7只。分别于实验第11周、第16周取颈动脉组织行HE染色以观察病理变化；ELISA法检测细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、白介素-6（IL-6）表达水平；荧光定量PCR检测ICAM-1 mRNA表达。结果与自然消退组比较，活血通脉颗粒中、高剂量组和辛伐他汀组ICAM-1、IL-6水平明显下降（P＜0.05），与活血通脉颗粒低剂量组比较，活血通脉颗粒高剂量组、辛伐他汀组明显下降（P＜0.05）；与自然消退组比较，各治疗组ICAM-1 mRNA表达明显下降（P＜0.05）。结论活血通脉颗粒可能通过抑制ICAM-1、IL-6表达水平从而干预家兔动脉粥样硬化的形成。

活血通脉颗粒 颈动脉粥样硬化 ICAM-1 IL-6 兔

颈动脉粥样硬化（CAS）是以颈部血管平滑肌细胞增多和脂质在CAS斑块沉积为特点，危害人类健康最严重的疾病之一。CAS造成的急性脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高及复发率高等特点［1-2］。本研究观察活血通脉颗粒对CAS兔模型细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、白介素-6（IL-6）表达水平的影响，为活血通脉颗粒干预CAS形成提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰大白兔75只，雌雄不限，（2000±500）g，清洁级，购于昆明医科大学实验动物学部，合格证号：SCXK（滇）2011-0004。通风及自然光照下饲养，室内温度18～25℃，湿度45～60℃。

1.2 药物与试剂 活血通脉颗粒：由红景天、虎杖、三七粉、水蛭、茯苓、隔山消等组成，每包15 g，由云南省中医医院制剂中心配制。辛伐他汀，商品名舒降之，规格40 mg/片，由默沙东制药有限公司生产 （产品批号K005133）。纯化胆固醇，由安徽天启公司提供（批号20140316），蛋黄粉，由同和生物公司提供 （批号20130305），兔IL-6 ELISA检测试剂盒、兔ICAM-1检测试剂盒，均为卡尔文生物科技有限公司Biocalvin系列 ELISA试剂盒。Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂，货号DRR047A，SYBR Premix EX TaqTM 试剂，货号 DRR041A，Takara RNAiso Plus Reagent试剂，货号D9108，Easy dilution试剂，货号D9160，DEPC Free H2O试剂货号D358，以上试剂购于大连宝生物公司。DNP-9052型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），Sunrise-basic Tecan酶标仪（瑞士Tecan公司），移液枪：Thermo labsystems，规格：20～200 μL，ABI2720 PCR仪（美国ABI），GenequantⅡ分光光度计（美国Pharmacia），ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI）。

1.3 模型制备 兔适应性喂养1周后，随机抽取10只为正常组，饲养基础饲料，65只饲养高脂饲料（78%基础饲料中加入7%猪油，14%蛋黄粉，1%胆固醇）。连续饲养11周后抽取两只家兔处死，取颈动脉血管在光镜下观察血管外膜组织病理变化。镜下显示动脉内膜粗糙、显著增厚，部分出现纤维脂肪性病变和局部粥样化病灶，大量脂质颗粒沉积，并伴有大量泡沫样细胞，内皮细胞排列紊乱、不规则，伴有大量平滑肌细胞移行至内膜下增生，提示造模成功［3］。最终获得成功模型兔35只。

1.4 分组与给药 将模型兔随机分为自然消退组、活血通脉颗粒低、中、高剂量组、辛伐他汀组5组，每组7只，基础饲料饲养5周，每日灌胃1次，均自由饮水。根据临床用药剂量，常用实验动物及人的体表面积比例［4］（剂量换算用），每1 kg体质量的实验兔每天给予1.87 mg辛伐他汀，蒸馏水溶解混匀后灌胃。自然消退组予等体积蒸馏水灌胃。活血通脉颗粒低（生药5.5 g/kg，相当于人的临床剂量的2倍）、中（生药11 g/kg，相当于人的临床剂量的4倍）、高剂量组（生药22 g/kg，相当于人的临床剂量的8倍）予相应剂量药物。连续灌胃5周。

1.5 检测指标

1.5.1 颈动脉标本病理观察 分别取于实验第11周、第16周，取家兔颈动脉组织，将其浸入10%中性缓冲甲醛液固定，用水将未与组织结合的固定液及沉淀物洗涤，之后脱水、透明、浸蜡，常规石蜡包埋切片，在实验兔的颈总动脉取相同的切面，切片厚5 μm，HE染色。光镜下观察组织的病理改变。

1.5.2 ELISA法检测ICAM-1、IL-6 取家兔血清4℃冷冻离心，3000 r/min离心10 min，提取上清液，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶 （HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.5.3 荧光定量PCR方法检测ICAM-1 mRNA表达取组织块100 mg与研钵体中，加入液氮研磨成粉末，移入玻璃匀浆器中，加入1 mL Trizol液进行匀浆处理。采取苯酚-氯仿法提取总RNA。进行cDNA的合成，逆转录反应体系。引物制备用GAPDH作为内参照，序列如下：rICAM-1上游引物5′-TGCTCCGCCTTCCACC AG-3′，下游引物5′-TGGCACCACGCAGTCCTC-3′，rGAPDH上游引物5′-AGAGCACCAGAGGAGGACG-3′，下游引物5′-TGGGATGGAAACTGTGAAGAG-3′。实时荧光定量PCR反应体系如下：SYBR Green PCR master mix 12.5 μL；正向和反向引物各0.5 μL；蒸馏水9.5 μL；cDNA 1 μL混合均匀。每个基因设5个梯度标准品及阴性对照，待测样品两次重复反应。反应条件为：95℃30 s变性，95℃5 s，60℃31 s，28～34个循环。反应完毕，数据采用ABI7500 SDS Software分析，用公式2-△△Ct方法进行相对定量。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验，多样本组间比较（M）用单因素方差法。数据进行方差齐性检验，假定方差齐时，用两两比较LSD法，方差不齐时，Dunnett′s T3法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CAS模型的建立 喂养11周后，正常组颈动脉内膜完整、较薄，平滑肌及平滑肌细胞排列整齐，无动脉粥样硬化斑块和泡沫细胞。模型组内膜明显增厚，伴有大量泡沫细胞堆积，细胞排列不规则，细胞大小、形态差异大。提示造模成功（见图1）。

2.2 家兔ELISA检测结果 给药5周后，活血通脉颗粒中、高剂量组和辛伐他汀组与自然消退组相比兔血清ICAM-1和IL-6水平降低（P＜0.05），活血通脉颗粒高剂量组及辛伐他汀组ICAM-1的表达水平低于活血通脉颗粒低剂量组（P＜0.05）；活血通脉颗粒中、高剂量组及辛伐他汀组IL-6的表达水平低于活血通脉颗粒低剂量组（P＜0.05）。

图1 两组颈动脉HE染色（200倍）

表1 各组家兔血清中ICAM-1和IL-6水平比较（±s）

表1 各组家兔血清中ICAM-1和IL-6水平比较（±s）

与活血通脉颗粒低剂量组比较，*P＜0.05；与自然消退组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 n I C A M -1（n g / m L）I L -6（p g / m L）正常组 1 0 7 4 . 5 4 ± 2 . 8 4 4 3 . 2 4 ± 2 . 4 7模型组 6 3 6 2 . 8 4 ± 1 0 . 5 3 1 9 9 . 8 0 ± 8 . 5 2自然消退组 7 3 0 4 . 9 8 ± 5 . 5 7 1 7 3 . 0 9 ± 7 . 7 5活血通脉颗粒低剂量组 7 2 8 3 . 8 7 ± 8 . 7 9 1 6 3 . 7 1 ± 9 . 2 4活血通脉颗粒中剂量组 7 2 5 7 . 6 1 ± 9 . 8 2△1 4 8 . 3 9 ± 6 . 0 3*△活血通脉颗粒高剂量组 7 2 3 2 . 9 7 ± 6 . 2 1*△1 2 3 . 8 9 ± 5 . 9 5*△辛伐他汀组 7 2 2 0 . 2 6 ± 5 . 3 5*△1 1 2 . 1 1 ± 4 . 8 5*△

2.3 家兔颈动脉ICAM-1 mRNA表达 正常组兔颈动脉组织中ICAM-1mRNA相对含量为（3.19±0.24）%，模型组为 （22.47±2.52）%，自然消退组为 （19.47± 1.81）%，活血通脉颗粒低剂量组为（14.38±0.76）%，活血通脉颗粒中剂量组为（10.23±0.59）%，活血通脉颗粒高剂量组为（8.69±0.43）%，辛伐他汀组为（7.17± 0.4）%，与自然消退组比较，各组均有显著差异 （P＜0.05）。

3 讨 论

研究表明，炎症反应贯穿于AS起始、进展及斑块破裂血栓形成的全过程，是不稳定斑块发生破裂的中心环节［5］。炎症反应的激活可致斑块不稳定甚至破裂，血小板聚集及血栓形成，进而触发急性不良事件。因此，通过抑制炎症反应来延缓AS的发生发展，特别是稳定斑块，防止破裂，已经成为该领域的重要研究方向。ICAM-1是内皮细胞活化标志之一。在内皮功能损伤情况下，大量炎性介质、细胞因子等能诱导ICAM-1蛋白及mRNA的表达，参与T细胞反应、促进单核细胞与内皮细胞的黏附，最终促进或加剧AS等多种疾病的发生和发展［6］。IL-6是介导炎症反应和免疫调节的促炎细胞因子，可通过诱导血小板源性生长因子（PDGF）促进血管平滑肌增殖，从而加快AS进程。ICAM-1在AS病变早期主要促使单核细胞向内皮黏附、迁移，而单核细胞、T淋巴细胞与血管内皮细胞发生黏附，代表AS早期炎症的开始。在AS进展期ICAM-1主要促进已迁入病灶的单核细胞滚动、T淋巴细胞激活，并增加其他细胞间的相互作用。IL-6水平升高可能标志炎症状态的存在。ICAM-1在中性粒细胞迁移和内皮细胞黏附致AS过程中起重要作用，在血管内皮细胞表达最强。ICAM-1的激活参与多种相关因子的释放和表达，从而加快AS的进程。有研究表明颈动脉斑块的高血压患者血清IL-6显著高于无斑块患者，提示炎症反应可能在CAS病变发展过程中起着更为重要的作用［7］。

中医学认为CAS其本虚涉及心、肝、脾、肺、肾诸脏虚损，标实是指瘀血、痰浊、水湿阻滞脉道，而标实又是形成本病的关键。因此，“血瘀痰浊”之病机贯穿于CAS发病的整个过程，祛痰降浊、健脾益气、活血化瘀之法乃是治疗的关键。活血通脉颗粒由红景天、虎杖、三七、水蛭、茯苓、隔山消等组成，为赵淳教授经验方。其功效为活血通脉、解毒祛痰，临床疗效确切。

从研究结果发现，活血通脉颗粒中、高剂量组ICAM-1和IL-6的表达水平低于自然消退组，家兔颈动脉组织中ICAM-1 mRNA的相对含量中活血通脉颗粒组低于自然消退组，说明活血通脉颗粒能有效地降低细胞因子ICAM-1、IL-6相对含量，提示活血通脉颗粒可能通过抑制AS血管壁ICAM-1活性、下调IL-6的表达从而干预CAS进程。这为临床上应用活血通脉颗粒防治CAS提供了新的理论依据。

［1］ 王平平，高利.颈动脉粥样硬化的中西医结合研究进展［J］.中国中西医结合急救杂志，2007，14（2）：125-128.

［2］ 孙秀娟.颈动脉粥样硬化的中西医药治疗进展［J］.中国药房，2011，22（27）：2585-2586.

［3］ Shimizu N，Suzuki H，Wakabayashi K，et al.Expression of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in the pig coronary artery injury model：comparison of plain old balloon angioplasty and stent implantation［J］. J Cardiol，2004，43（3）：131-139.

［4］ 艾志兵，何厚国，李承宴，等.家兔颈动脉粥样硬化模型的建立［J］.卒中与神经疾病，2005，12（2）：96-99.

［5］ 秦川.实验动物学［M］.北京：人民卫生出版社，2010：420-421.

［6］ Libby P.Inflammation in atherosclerosis［J］.Nature，2002，420：868-874.

［7］ 丁东新，薛冰，沈琪.细胞因子TNF-α、IL-6与老年高血压患者合并颈动脉粥样硬化的关系［J］.中国医药指南，2008，6（1）：126-127.

Effect of the Huoxue Tongmai Granule on ICAM-1 and IL-6 of Arotid Atherosclerosis Rabbit

XIE Jian1，TONG Xiaoyun2，SHEN Chao2，et al. 1 Yunnan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine，The First Affiliated Hospital of Yunnan University of TCM，Yunnan，Kunming 650021，China；2 Yunan University of TCM，Yunnan，Kunming 650500，China

Objective：To invigorate the mechanism of Huoxue Tongmai Granule intervention the rabbit with carotid atherosclerosis（CAS）.Methods：In the 75 New Zealand white rabbit，randomly selected 10 for the normal group，the remaining 65 rabbits were established by the high-fat feed carotid atherosclerosis model.After 11 weeks，the models were randomly divided into the model group，the natural healing group，the Huoxue Tongmai Granule low，medium and high dose group，simvastatin group with 7 rabbits in each group.11 weeks experiment respectively，and week 16 carotid line organization HE staining was used to observe the carotid artery tissue pathological changes.Meanwhile，ELISA method for detection of ICAM-1 and IL-6 expression were dectected by the ELISA method.ICAM-1 mRNA expression was observed by the fluorescence quantitative PCR detection.Results：Compared with the natural healing group，ICAM-1 and IL-6 expression was decreased obviously in the Huoxue Tongmai Granule middle and high dose group（P＜0.05）.Compared with Huoxue Tongmai Granule lowdose group，the high-dose group and the simvastatin group were significantly decreased（P＜0.05）.Compared with the natural healing group，the mRNA expression of ICAM-1 was significantly decreased in the treatment group（P＜0.05）.Conclusion：Huoxue Tongmai Granule could inhibit ICAM-1and IL-6 expression level for the intervention of the formation of atherosclerosis.

Huoxue Tongmai Granule；Carotid atherosclerosis；ICAM-1；IL-6；Rabbit

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0396-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.007

2014-12-23）

云南省自然科学基金资助项目（2011FZ264）；国家中医药管理局“名老中医药专家工作室”建设项目