大黄鞣质对大鼠创伤性脑损伤继发脑水肿抑制作用的研究*

张 铂王 兵王勇强曹书华△

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津市第一中心医院，天津 300192；3.天津市环湖医院，天津 300060）

·研究报告·

大黄鞣质对大鼠创伤性脑损伤继发脑水肿抑制作用的研究*

张 铂1，2，3王 兵2王勇强2曹书华2△

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津市第一中心医院，天津 300192；3.天津市环湖医院，天津 300060）

目的观察大黄鞣质对SD大鼠创伤性脑损伤继发脑水肿的抑制作用并探讨其作用机制。方法采用Feeney自由落体坠击法制备大鼠创伤性脑损伤模型，腹腔注射大黄鞣质，测定给药后大鼠脑组织含水量、血管通透性及SOD水平的变化，采用免疫组织化学法和蛋白质免疫印迹法测定大鼠脑组织AQP4和GFAP表达的变化。结果与模型组相比，给药组大鼠脑组织含水量显著下降（P＜0.05），脑组织SOD水平显著提高（P＜0.05），血管通透性明显下降（P＜0.05）；免疫组化法检测给药组大鼠AQP4和GFAP的阳性细胞数减少，颜色变浅，阳性细胞表达评分明显低于模型组各亚组（P＜0.01）；蛋白印迹免疫试验法检测给药组AQP4和GFAP的阳性表达下降，其表达量与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论大黄鞣质对大鼠创伤性脑损伤继发脑水肿的抑制作用与降低血管通透性、增加SOD水平和降低水通道蛋白AQP4和GFAP的表达有关。

大黄鞣质 脑损伤 脑水肿 抑制作用

创伤性脑损伤（TBI）是重症医学领域的常见疾病，该病致死、致残率高，是外伤性死亡的首要原因［1］。创伤性脑水肿是创伤性脑损伤的继发症，主要包括血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿两种类型，是创伤性脑损伤后的一种病理、生理反应，抑制脑创伤后继发的脑组织水肿是降低脑创伤危险因素的关键。鞣质是存在于植物体内的多酚类化合物，可有效清除体内自由基，防止脂质氧化对机体造成的损伤，能与蛋白质结合产生沉淀，表现出良好的收敛作用。鞣质是大黄的重要活性成分，大黄鞣质在大黄生药材中含量达30%，其单体成分主要包括没食子酸（gallic acid）和d-儿茶素（d-catechin）［2］。研究显示，大黄鞣质具有抗脂质过氧化、抗炎、抗过敏及止血收敛等多种作用［3］，但大黄鞣质用于减轻创伤性脑水肿的研究鲜有报道。本文系统报道了大黄鞣质单体没食子酸、d-儿茶素对创伤性脑损伤的保护作用及其作用机制，为大黄鞣质在创伤性脑损伤中的应用研究提供参考。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠120只 （由天津医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK2014-0003），6～8周龄，体质量220～250 g。

1.2 药物与试剂 没食子酸（纯度＞98%，成都植标化纯生物技术有限公司）；d-儿茶素（纯度＞98%，成都植标化纯生物技术有限公司）；Evans Blue（北京索莱）；苏木素染色液（北京赛驰生物科技有限公司）；甲醛（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；苯甲基磺酰氟（分析纯，天津永大化学试剂有限公司）。

1.3 模型制备 采用Feeney自由落体法制作大鼠脑损伤模型，SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/ 100 g，麻醉后将大鼠俯卧固定于手术台上，在左侧颅脑实施开颅手术，行头部正中纵行切口，剥离骨膜，暴露前囟和矢状缝；在大鼠前囟后方1.5 mm，中线右侧2.5 mm处钻一直径为5 mm的骨洞，保持硬脑膜完整；将自由落体装置底座置于右顶部骨窗的硬脑膜表面，20 g砝码从30 cm高处自由坠落至金属圆柱体表面，击中打击棒，下陷深度为0.25 cm，致大鼠中度脑损伤。用骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，即得大鼠脑创伤模型。假手术模型只开颅、手术、缝合，不做坠击创伤。

1.4 分组与给药 将120只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和给药组，每组以脑损伤后时间点再随机分为12、24、48 h和72 h 4个亚组，每个亚组10只。假手术组、模型组腹腔注射生理盐水10 mL/（kg·24 h），给药组于创伤模型制备完成后立即腹腔注射含没食子酸和d-儿茶素的生理盐水溶液10 mL/（kg·24 h），相当于给药没食子酸和d-儿茶素剂量100 mg/（kg·24 h）。

1.5 检测指标 （1）对脑组织含水量的影响。分别于给药后12、24、48、72 h，开颅取损伤侧大脑半球，准确称取湿重后，置于100～110℃的烤箱中烘烤24 h至恒重，称取质量，记录干重，以假手术组、模型组为对照，比较给药后脑组织含水量的变化。按下式计算脑组织含水量：脑组织含水量 （%）=（湿重-干重）／湿重× 100%。（2）对脑血管通透性的影响。伊文氏蓝标准曲线：称取伊文氏蓝8 mg，采用生理盐水定容至50 mL，分别取适当体积的伊文氏蓝加至甲酰胺溶液中，质量浓度分别为10、8、4、2、1 μg/mL，60℃孵育24 h，设定检测波长632 nm，测定A值，计算线性回归方程，以质量浓度为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，线性回归，得方程y=0.123x+0.015，r=0.9998，在1～10 μg/mL范围内，质量浓度与吸收度值线性关系良好。于取样点前2 h经股静脉缓慢注入2.5%伊文氏蓝 （EB，0.2 mL/ 100 g），麻醉大鼠，分别于给药12、24、48、72 h时间点，开胸经左心室至升主动脉插管，生理盐水快速冲净血液后断头取脑，取损伤侧大脑半球脑组织，浸泡在甲酰胺溶液中，60℃避光水浴24 h，取出组织，浸出液4000 r/min离心30 min，取上清液，按上述方法测定吸收值，计算EB含量（μg/g湿重脑组织），以假手术组、模型组为对照，比较给药后脑血管通透性的变化。（3）对脑组织超氧化物歧化酶（SOD）水平的影响。分别于给药12、24、48、72 h时间点，断头处死大鼠，取损伤侧大脑半球皮层组织100 mg。置于9.9 mL pH7.4的PBS液中，高速匀浆后，20000 r/min离心10 min，取上清液5 μL，按试剂盒法测定SOD活性［4］。（4）对脑组织AQP4和GFAP表达的影响。采用IHC检测脑组织AQP4和GFAP的表达［5］，根据脑组织细胞核或细胞质中有棕黄色或棕褐色颗粒的细胞判断为AQP4或GFAP表达阳性细胞。对各组AQP4表达评分，先按阳性细胞比例将0～1%、1%～10%、10%～50%、50%～80%、80%～100%分别记为0、1、2、3、4分；再按染色强度将无、弱、中、强分别记为0、1、2、3分，将两者得分相乘后进行统计学分析。采用蛋白质免疫印迹试验，分别以AQP4和GFAP和内参β-肌动蛋白（β-actin）的积分吸光度（A）值比值进行统计学分析［6］。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组脑组织水含量比较 见表1。与假手术组相比，模型组大鼠脑损伤后12、24、48、72 h的脑组织水含量均显著上升（P＜0.05）；与模型组相比，给药组大鼠的脑组织水含量均显著下降（P＜0.05），与假手术组相当。

表1 各组创伤性脑损伤大鼠脑组织水含量比较（%，±s）

表1 各组创伤性脑损伤大鼠脑组织水含量比较（%，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手术组 1 0模型组 1 0 7 7 . 9 3 ± 0 . 1 8 7 7 . 9 8 ± 0 . 2 0 7 7 . 9 0 ± 0 . 4 1 7 7 . 6 4 ± 0 . 5 1 8 0 . 4 9 ± 0 . 4 9*8 1 . 5 1 ± 0 . 6 0*8 0 . 3 6 ± 0 . 6 2*7 8 . 7 1 ± 0 . 4 1*给药组 1 0 7 8 . 3 9 ± 0 . 5 7△7 9 . 8 7 ± 0 . 4 3△7 8 . 9 4 ± 0 . 4 8△7 7 . 9 3 ± 0 . 6 7△

2.2 各组脑血管通透性比较 见表2。模型组大鼠脑损伤后12、24、48、72 h的脑血管通透性与假手术组相比均显著上升（P＜0.01）；给药组脑血管通透性与模型组相比显著下降（P＜0.05），与假手术组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组创伤性脑损伤大鼠对脑血管通透性比较（μg/g，±s）

表2 各组创伤性脑损伤大鼠对脑血管通透性比较（μg/g，±s）

组别 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手术组 1 0模型组 1 0 2 . 7 2 ± 0 . 7 3 2 . 7 1 ± 0 . 6 9 2 . 7 2 ± 0 . 7 1 2 . 7 1 ± 0 . 7 2 6 . 1 0 ± 0 . 6 8**6 . 0 9 ± 0 . 6 7**6 . 1 1 ± 0 . 6 7**6 . 1 0 ± 0 . 6 6**给药组 1 0 4 . 1 2 ± 0 . 3 1△4 . 1 1 ± 0 . 3 0△4 . 1 3 ± 0 . 2 9△4 . 1 2 ± 0 . 3 2△

2.3 各组脑组织SOD水平比较 见表3。与假手术组相比，模型组大鼠脑损伤后12、24、48、72 h的SOD水平显著下降（P＜0.01），与模型组相比，给药组大鼠的SOD水平显著上升（P＜0.01），与假手术组相当。

表3 各组创伤性脑损伤大鼠脑组织SOD水平比较（U/mg，±s）

表3 各组创伤性脑损伤大鼠脑组织SOD水平比较（U/mg，±s）

组别 n 1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h假手术组 1 0模型组 1 0 1 2 7 . 2 2 ± 0 . 3 2 1 2 7 . 3 1 ± 0 . 3 4 1 2 7 . 2 4 ± 0 . 3 1 1 2 7 . 3 1 ± 0 . 2 9 1 0 1 . 1 4 ± 0 . 4 1**1 0 2 . 2 1 ± 0 . 2 7**1 0 1 . 5 6 ± 0 . 3 6**1 0 3 . 5 3 ± 0 . 4 3**给药组 1 0 1 2 3 . 2 7 ± 0 . 3 7△△1 2 4 . 3 2 ± 0 . 3 9△△1 2 3 . 4 9 ± 0 . 2 7△△1 2 3 . 5 8 ± 0 . 2 9△△

图1 各组大鼠脑组织AQP4阳性细胞表达

图2 各组大鼠脑组织GFAP阳性细胞表达

表4 各组大鼠脑组织AQP4和GFAP的表达比较（分，±s）

表4 各组大鼠脑组织AQP4和GFAP的表达比较（分，±s）

1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h 2 . 3 3 ± 0 . 2 2 4 . 2 8 ± 0 . 5 3 3 . 9 9 ± 0 . 1 9 3 . 8 7 ± 0 . 5 7 3 . 2 1 ± 0 . 1 1 5 . 0 0 ± 0 . 8 2 4 . 9 8 ± 0 . 3 9 4 . 5 3 ± 0 . 6 2 3 . 3 4 ± 1 . 2 1*6 . 5 8 ± 1 . 3 2*6 . 3 7 ± 1 . 1 9*5 . 7 8 ± 1 . 5 3*（n = 1 0） G F A P 4 . 8 3 ± 1 . 2 9**7 . 8 1 ± 1 . 7 5**7 . 1 7 ± 1 . 7 6**6 . 7 3 ± 1 . 6 1**给药组 A Q P 4 2 . 5 6 ± 0 . 4 7△4 . 5 1 ± 0 . 5 2△4 . 1 3 ± 0 . 4 1△4 . 1 1 ± 0 . 3 5△（n = 1 0） G F A P 3 . 3 7 ± 0 . 2 6△△5 . 9 2 ± 0 . 7 1△△5 . 2 7 ± 0 . 6 5△△4 . 9 8 ± 0 . 7 3△△组别 指标假手术组 A Q P 4（n = 1 0） G F A P模型组 A Q P 4

图3 各组大鼠脑组织AQP4水平

图4 各组脑组织GFAP水平WB测定结果

2.4 各组脑组织AQP4和GFAP表达比较 （1）免疫组化法。见图1～2，表4。细胞核或胞质中存在棕黄色或棕褐色颗粒为AQP4和GFAP阳性细胞。与假阳性组相比，模型组大鼠脑损伤后12、24、48、72 h可见大量AQP4和GFAP阳性细胞，且染色较深；给药组在脑损伤后12、24、48、72 h可见AQP4和GFAP阳性细胞，数量较模型组相应时间段减少，且颜色稍浅，而假手术组脑组织中仅可见少量散在的AQP4和GFAP阳性细胞。模型组各相应时间段AQP4和GFAP阳性细胞表达评分高于假手术组（P＜0.01）；与模型组比较，给药组各相应时间段脑组织中AQP4和GFAP阳性细胞数减少，阳性细胞表达IHC评分明显低于模型组各相应时间段（P＜0.01）。（2）蛋白质免疫印迹法。见图3～4，表5。假手术组仅见少量散在的AQP4和GFAP阳性细胞，与假手术组相比，模型组可见大量的AQP4和 GFAP阳性细胞表达，与模型组相比，给药组AQP4和GFAP的阳性表达下降。与假手术组比较，模型组各时间段脑组织AQP4和GFAP表达量明显增加 （P＜0.01），表明造模成功，给药组各时间段脑组织AQP4和GFAP表达量下降，与模型组对应各时间段相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表5 各组创伤性脑损伤大鼠脑组织AQP4、GFAP表达水平比较（±s）

表5 各组创伤性脑损伤大鼠脑组织AQP4、GFAP表达水平比较（±s）

1 2 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h 0 . 4 2 ± 0 . 0 5 0 . 4 3 ± 0 . 0 4 0 . 4 1 ± 0 . 0 6 0 . 4 2 ± 0 . 0 5 0 . 6 2 ± 0 . 0 3 0 . 6 3 ± 0 . 0 4 0 . 6 1 ± 0 . 0 3 0 . 6 2 ± 0 . 0 4 0 . 8 6 ± 0 . 0 8**1 . 4 3 ± 0 . 0 7**1 . 2 4 ± 0 . 0 8**1 . 0 6 ± 0 . 0 5**（n = 1 0） G F A P 1 . 0 2 ± 0 . 0 5**1 . 4 7 ± 0 . 0 6**1 . 2 9 ± 0 . 0 7**1 . 0 8 ± 0 . 0 5**给药组 A Q P 4 0 . 6 3 ± 0 . 0 5△△1 . 1 4 ± 0 . 0 4△△0 . 9 6 ± 0 . 0 7△△0 . 7 1 ± 0 . 0 6△△（n = 1 0） G F A P 0 . 8 4 ± 0 . 0 4△△1 . 2 1 ± 0 . 0 3△△1 . 0 6 ± 0 . 0 4△△0 . 8 9 ± 0 . 0 7△△组别 指标假手术组 A Q P 4（n = 1 0） G F A P模型组 A Q P 4

3 讨 论

中医理论认为脑损伤的主要病机是脑髓损伤，清窍阻闭，其治疗应以逐瘀通腑为原则，故泄下类中药在脑损伤中的应用较多。大黄是泄下类中药的代表药物。脑损伤后继发的脑水肿是临床常见的危险因素，脑损伤后氧自由基急剧增加，诱发脂质过氧化反应，导致膜磷脂和蛋白质的氧化，可直接损伤神经细胞，加重损伤的程度，故自由基蓄积与二次损伤过程密切相关。大黄鞣质富含酚羟基，具有很强的供氢能力，能有效清除体内自由基。本研究表明大黄鞣质可提高体内SOD水平，抑制炎性因子的释放，减轻脑水肿造成的二次损伤。大黄鞣质具有明显的收敛作用，研究发现，大黄鞣质在脑损伤早期即可拮抗脑水肿，并且对脑水肿有长时间缓解作用；血管源性脑水肿是继发性脑损伤的重要因素，本研究表明，大黄鞣质可降低损伤组织脑血管通透性，抑制脑水肿的程度，这可能是大黄鞣质对脑损伤保护作用的机制之一。

AQP4在神经系统广泛表达，其含量与脑水肿的程度亦呈现正相关性［7］。脑损伤后神经元、星形胶质细胞膨胀，尤其是星形胶质细胞的膨胀，是导致脑水肿的直接原因［8］，研究证实AQP4与GFAP在损伤脑组织中共同存在［9］。本研究发现脑损伤后72 h内AQP4表达水平显著上升，大黄鞣质给药后可显著降低其表达，表明大黄鞣质可减轻脑组织水肿程度。GFAP具有维持星形细胞形态和功能的作用，是星形胶质细胞的特异标志物，血清中浓度上升水平与创伤性脑损伤严重程度呈正相关［10］，本研究显示大黄鞣质可以显著降低脑损伤后GFAP蛋白表达水平，可缓解脑损伤后星形胶质细胞肿胀的程度。

本研究已表明大黄鞣质可提高SOD水平，降低大鼠损伤脑组织水含量、脑血管通透性及AQP4和GFAP的表达，从而对损伤脑组织起到较好的保护作用，大黄鞣质对脑损伤继发的肺损伤、应激性高血糖的保护机制及其临床应用效果有待进一步研究。

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Study of Rhubarb Tannins Effect on Acute Encephaledema by Rats with Encephaledema Followed by Traumatic Brain Injury

ZHANG Bo1，2，3，WANG Bing2，WANG Yongqiang2，et al.1 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2 Tianjin First Center Hospital，Tianjin 300192，China；3 Tianjin Huanhu Hospital，Tianjin 300060，China

Objective：To observe the influence of Rhubarb tannins on encephaledema followed by traumatic brain injury in SD rats.Methods：In order to prepare of traumatic brain injury model，the classic Feeney free fall drop was used to wounded rats.Rhubarb tannins were given rats by intraperitoneal injection.The brain of rat water content，cerebral vascular permeability，SOD level，cell AQP4 and GFAP expression using immune histochemical method and protein determination of western blot test were determination.Results：The brain of rat water content and the cerebral vascular permeability in the Rhubarb tannins group were significantly lower than those in the model group（P＜0.05）.The SOD level in Rhubarb tannins group was higher obviously than that in the model group（P＜0.05）.The AQP4 and the GFAP in Rhubarb tannins group were decreased remarkably.There were some statistical differences between the Rhubarb tannins group and the model group（P＜0.05）.Conclusion：Rhubarb tannins can cure encephaledema in rats followed by traumatic brain injury.Its mechanism is through reduction of cell AQP4 and GFAP expression，decrease of cerebral vascular permeability and increase of SOD level to achieve protective effect of encephaledema.

Rhubarb tannins；Brain injury；Encephaledema；Inhibition

R285.5

A

1004-745X（2015）03-0380-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.03.002

2014-12-13）

卫生部国家临床重点专科建设项目

△通信作者（电子邮箱：zhangbdr@126.com）