赤霉素GA3急性毒性和遗传毒性

商 桑，王 健，丁晓雯*

赤霉素GA3急性毒性和遗传毒性

商 桑，王 健，丁晓雯*

（西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工重点实验室，重庆 400715）

目的：研究赤霉素GA3的急性毒性和遗传毒性，为合理使用赤霉素以及赤霉素残留限量标准的制定提供参考。方法：采用最大剂量耐受法测定赤霉素GA3的急性毒性，采用蚕豆根尖细胞微核实验、小鼠骨髓细胞微核实验和小鼠精子畸形实验测定赤霉素GA3的遗传毒性。结果：给昆明种小鼠经口灌胃赤霉素GA3，LD50＞15 000 mg/kg；赤霉素GA3在质量浓度为0.1～2.0 mg/L范围内时，蚕豆根尖细胞微核率呈上升趋势，与阴性对照组相比均存在极显著差异，且微核指数均＞1.5；7.5 g/kg赤霉素GA3对雌、雄小鼠的骨髓细胞微核率分别为7.47‰、7.07‰，小鼠精子畸形率为5.47%，与阴性对照组相比均存在极显著差异（P＜0.01）。结论：赤霉素GA3的急性毒性虽然比较低，属于无毒级，但是在较高剂量条件下对植物细胞、动物的体细胞与生殖细胞均具有遗传毒性，应尽快制定赤霉素GA3使用限量标准。

赤霉素A3；急性毒性；遗传毒性

赤霉素是一种生物活性高、应用广泛的植物激素类农药，具有促进种子萌发、茎伸长、叶片发育、花和果实发育等作用[1]，至今已发现100多种赤霉素，其中赤霉素GA3的生物活性最高、应用最广泛[2]。赤霉素GA3又名赤霉酸、“九二0”、“奇宝”，美国、日本等国家规定水果和蔬菜中赤霉素GA3的最高残留限量为0.2 mg/kg[3]，而我国目前还未出台相应的农产品限量标准。

目前对赤霉素GA3的毒理学安全性评价的报道很少，也无赤霉素GA3导致人体中毒的报道，所以有必要对赤霉素GA3的安全性进行评价。本实验通过急性毒性实验和遗传毒性实验（包括蚕豆根尖细胞微核实验、小鼠骨髓细胞微核实验和小鼠精子畸形实验）对赤霉素GA3的安全性进行初步评价，以期为科学、合理地使用赤霉素GA3以及赤霉素GA3残留限量标准的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

蚕豆为优质小青皮豆，重庆当地产，当年新种，购于重庆市北碚区天生农贸市场。

SPF级昆明种小鼠，体质量25～30 g，重庆市中药研究院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（渝）2007-0006。

赤霉素GA3（纯度90%） 上海源叶生物公司；Giemsa染液 上海馨晟试化工科技有限公司；环磷酰胺山西普德药业有限公司；小牛血清 广州蕊特生物科技有限公司；甲醇、酚酞、碱性品红、偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）、硫代硫酸钠（Na2S2O3）、伊红、甘油等试剂均为分析纯 成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

XSN-3G型显微镜 重庆光电仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 急性毒性实验[4]

采用最大耐受剂量法进行急性毒性实验：称取7.500 g赤霉素GA3于研钵中，将其研磨成粉末状，用蒸馏水定容至10 mL。选用昆明种小鼠雌、雄各10 只，每日给予小鼠最大灌胃剂量20 mL/kg（以体质量计，下同）的赤霉素GA3，连续观察14 d，记录小鼠中毒表现及死亡情况。

1.3.2 蚕豆根尖细胞微核实验[5]

将赤霉素GA3用蒸馏水配制成不同质量浓度的溶液，设阴性对照组（蒸馏水）、阳性对照组（环磷酰胺10 mg/L）、实验组（赤霉素GA30.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/L）。蚕豆于24 ℃蒸馏水中浸泡36 h，湿纱布包裹催芽36 h，选已发芽的蚕豆放入垫有湿脱脂棉的培养皿中培养36 h，每12 h换水一次。选择根芽整齐一致，根长约1.0～1.5 cm的蚕豆随机分组。每组随机挑选6～8 粒发芽种子，置于盛放待测液的培养皿中浸泡4～6 h。处理后的种子用蒸馏水浸洗，再放入垫有湿脱脂棉的培养皿中回复培养24 h。切下1 cm根尖，用卡诺氏固定液（甲醇-冰乙酸（3∶1，V/V））固定24 h，放入体积分数70%的乙醇中4 ℃保存。常规制片，改良苯酚品红染液染色，压片镜检，每组观察5 个根尖，每个根尖计数1 000 个细胞，记录含微核的细胞数，按公式（1）、（2）计算微核率及微核指数。

在阳性对照组的微核率显著增加，表示实验系统成立的情况下，若实验组的微核率与阴性对照组比较有显著差异，且微核指数≥1.5，则判断赤霉素GA3可能具有致突变性[6]。

1.3.3 小鼠骨髓细胞微核实验[7]

用蒸馏水配制3 个不同质量浓度的赤霉素GA3溶液，即高剂量组（1/2 LD50）、中剂量组（1/4 LD50）及低剂量组（1/8 LD50），并设阴性对照组（蒸馏水）及阳性对照组（2 mg/mL环磷酰胺）。选用7～12 周龄，体质量25～30 g的昆明种小鼠，每组10 只，雌雄各半。采用30 h给受试物法对小鼠经口灌胃，首次灌胃后间隔24 h第2次灌胃受试物，6 h后立即处死小鼠。取小鼠胸骨或股骨，按照GB 15193.5—2003《骨髓细胞微核试验》[7]中的方法制片及观察。每只小鼠计数1 000 个嗜多染红细胞，记录含微核的嗜多染红细胞数，按公式（3）计算微核率。

1.3.4 小鼠精子畸形实验[8]

用蒸馏水配制3 个不同质量浓度的赤霉素GA3，即高剂量组（1/2 LD50）、中剂量组（1/4 LD50）及低剂量组（1/8 LD50），并设阴性对照组（蒸馏水）及阳性对照组（2 mg/mL环磷酰胺）。选用6～8 周龄，体质量25～35 g的成年雄性小鼠，连续灌胃受试物5 d，每天1 次。首次给受试物35 d后处死小鼠，取出副睾，按照GB 15193.7—2003《小鼠精子畸形试验》[8]中的方法制片及观察。每只小鼠计数1 000 条完整精子，检查精子头部和尾部的形态是否异常，记录精子畸形数，按公式（4）计算精子畸形率。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 急性毒性实验结果

经过预实验可知赤霉素GA3的急性毒性较小，因此采用最大耐受剂量法对其进行急性毒性评价。

将质量浓度为0.75 g/mL的赤霉素GA3按照0.4 mL/20 g的最大灌胃剂量给予小鼠，连续观察14 d，小鼠未出现死亡情况，也没有任何中毒表现。表明赤霉素GA3对昆明种小鼠经口急性毒性最大耐受剂量＞15 g/kg，即LD50＞15 000 mg/kg。

2.2 蚕豆根尖细胞微核实验结果

表1 赤霉素GA3对蚕豆根尖细胞微核率的影响Table1 Frequencies of micronucleus in Vicia ffaabbaa root tips exposed to

表1 赤霉素GA3对蚕豆根尖细胞微核率的影响Table1 Frequencies of micronucleus in Vicia ffaabbaa root tips exposed to

注：**.与阴性对照组比较，差异极显著（P＜0.01）。下同。

组别质量浓度/（mg/L）微核率/‰微核指数阴性对照组（蒸馏水）011.51±1.731.00阳性对照组（环磷酰胺）1031.45±2.34**2.73实验组（赤霉素GA3）0.117.48±1.86**1.52 0.223.90±2.10**2.08 0.431.18±2.20**2.71 0.634.92±2.58**3.03 0.841.38±2.21**3.60 1.047.69±1.85**4.14 2.050.51±1.74**4.39

由表1可知，在赤霉素GA3质量浓度为0.1～2.0 mg/L范围内，蚕豆根尖细胞微核率呈逐渐上升趋势，与阴性对照组相比均存在极显著差异（P＜0.01），且微核指数均＞1.5。

2.3 小鼠骨髓细胞微核实验结果

图1 正常及含微核的嗜多染红细胞Fig.1 Normal polychromatic erythrocytes and polychromatic erythrocytes with micronucleus

由图1可知，正常的嗜多染红细胞较圆，呈淡紫色；而含微核的嗜多染红细胞稍大，且在细胞内有一个深紫色的微核，微核直径约为细胞直径的1/10。

表2 赤霉素GA3对小鼠骨髓细胞微核率的影响Table2 Frequencies of micronucleus in polychromatic erythrocytesTable2 Frequen exposed to GA o GA3

表2 赤霉素GA3对小鼠骨髓细胞微核率的影响Table2 Frequencies of micronucleus in polychromatic erythrocytesTable2 Frequen exposed to GA o GA3

小鼠性别组别灌胃剂量/（g/kg）微核率/‰雄性阴性对照组3.07±0.55阳性对照组0.04022.93±1.52**赤霉素GA3低剂量组1.8753.13±0.45赤霉素GA3中剂量组3.7503.67±0.62赤霉素GA3高剂量组7.5007.07±0.92**雌性阴性对照组2.93±0.55阳性对照组0.04022.53±0.84**赤霉素GA3低剂量组1.8753.20±0.65赤霉素GA3中剂量组3.7503.80±0.77赤霉素GA3高剂量组7.5007.47±1.10**

由表2可知，阳性对照组与阴性对照组相比存在极显著差异（P＜0.01），证明此条件下所获得的实验结果是可靠的。对于雄性小鼠，赤霉素GA3低、中、高剂量组的微核率分别为3.13‰、3.67‰、7.07‰，且赤霉素GA3高剂量组与阴性对照组相比存在极显著差异（P＜0.01）。对于雌性小鼠，赤霉素GA3低、中、高剂量组的微核率分别为3.20‰、3.80‰、7.47‰，且赤霉素GA3高剂量组与阴性对照相比存在极显著差异（P＜0.01）。

2.4 小鼠精子畸形实验结果

表3 赤霉素GA3对小鼠精子畸形率的影响TTaabbllee 33 FFrequencies of mice sperm abnormality exposed to GA3

表3 赤霉素GA3对小鼠精子畸形率的影响TTaabbllee 33 FFrequencies of mice sperm abnormality exposed to GA3

组别灌胃剂量/（g/kg）精子畸形率/%阴性对照组4.26±0.24阳性对照组0.0409.32±0.49**赤霉素GA3低剂量组1.8754.39±0.38赤霉素GA3中剂量组3.7504.60±0.39赤霉素GA3高剂量组7.5005.47±0.42**

由表3可知，阴性对照组及阳性对照组的小鼠精子畸形率分别为4.26%、9.32%，两者之间存在极显著差异，故认为此条件下实验结果是可靠的。赤霉素GA3低、中、高剂量组的小鼠精子畸形率分别为4.39%、4.60%、5.47%，且赤霉素GA3高剂量组与阴性对照组相比存在极显著差异（P＜0.01）。

图2 小鼠精子畸形类型及畸形数Fig.2 Types of sperm abnormality of mice exposed to GA3

由图2可知，赤霉素GA3各剂量组对小鼠精子畸形类型的影响以无定形为主，其次为尾折叠、香蕉形、无钩、胖头、小头，而双头、双尾较少。

3 结论与讨论

急性毒性是食品安全性毒理学评价程序的第一阶段，是指经口一次性给予或24 h内多次给予受试物后，动物在短时间内产生的毒性反应，包括致死和非致死的指标参数，致死剂量常用半数致死量LD50表示[4]。本实验结果表明，赤霉素GA3对昆明种小鼠经口最大耐受剂量＞15 g/kg，即LD50＞15 000 mg/kg，急性毒性较低。但有研究表明，赤霉素GA3对动物的肝脏功能会产生一定影响[9-13]，能促进鼠仔出生后的生长发育[14]，有神经毒害作用[15]，还会增加患皮肤炎症和膀胱疾病的机率[16]。

蚕豆根尖细胞微核实验是一种检测化学物质遗传毒性的方法。由于蚕豆根尖细胞在分裂时受到外界诱变因子的作用而产生不随细胞分裂进入细胞核的染色体小片段，可根据微核指数初步判断受试物是否具有致突变性及诱变严重程度[17]。因这种方法具有简便、经济、快速、重现性好、灵敏度高，且检测结果与动物实验结果较一致等优点，在致突变性的检测方面得到越来越广泛的应用，该技术应用范围已从最初的水环境[18]迅速扩展到食品[19]、药物[20]等复杂体系中致突变物的检测。已有文献表明赤霉素GA3有致癌性[21-25]和致畸性[26]。而本实验表明经0.1～2.0 mg/L赤霉素GA3处理的蚕豆根尖细胞微核率与阴性对照组存在极显著差异，且微核指数均＞1.5，初步判定赤霉素GA3可能具有致突变性。

小鼠骨髓细胞微核实验是一种通过骨髓嗜多染红细胞微核率以评价细胞遗传损伤的体内微核实验。红细胞受到外界诱变因子的作用可形成微核[27]。本实验中，与阴性对照组相比，高质量浓度的赤霉素GA3（7.5 g/kg）诱导的骨髓嗜多染红细胞微核率具有极显著差异（P＜0.01），表明赤霉素GA3对雌、雄小鼠体细胞均具有一定的遗传毒性。

小鼠精子畸形实验是一种通过观察精子形态变化以检测环境因子对生殖细胞致突变作用的体内实验。已知精子的畸形是精子基因突变的结果，因此精子形态的改变表明有关基因及其蛋白质产物发生了变化[8]。本实验结果表明，与阴性对照组相比，赤霉素GA3高剂量组（7.5 g/kg）的小鼠精子畸形率存在极显著差异（P＜0.01），表明赤霉素GA3对小鼠生殖细胞具有一定的遗传毒性。赤霉素GA3对小鼠精子畸形类型的影响以无定形为主，其次为尾折叠、香蕉形、无钩、胖头、小头，而双头、双尾则较少。

赤霉素GA3的急性毒性虽然较低，属于无毒级，但是在较高剂量（7.5 g/kg）条件下对植物细胞、动物的体细胞与生殖细胞都具有遗传毒性，应尽快制定赤霉素使用限量标准，以保证广大消费者的健康。

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Acute Toxicity and Genetic Toxicity of Gibberellin A3

SHANG Sang, WANG Jian, DING Xiaowen*(Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Purpose∶ To examine the acute toxicity and genotoxicity of gibberellin A3(GA3), which can provide scientificsupport for the reasonable use of GA3and a reference for establishing maximum residue limit (MRL) for GA3. Methods∶Acute toxicity was examined by using the maximum tolerated dose method while genotoxicity was examined usingViciamicronucleus test, bone marrow cell micronucleus test and sperm abnormality test in mice. Results∶ The acute oral LD50ofGA3in Kunming mice was > 15 000 mg/kg. As GA3concentration increased from 0.1 to 2.0 mg/L, the micronucleus rate ofVicia fabaroot tip cells showed a rising trend, which indicated a highly significant difference compared to negative controlsand the micronucleus index remained higher than 1.5 at all investigated GA3concentrations. The bone marrow micronucleusrates of male and female mice treated with 7.5 g/kg GA3were 7.47‰and 7.07‰, respectively, and the sperm malformationrate of mice was 5.47%, which revealed highly significant differences compared to that of negative controls (P＜ 0.01).Conclusion∶ Although GA3with low acute toxicity can be considered as a non-toxic substance, it causes genotoxicity to plantcells and animal somatic and germ cells at high doses. The MRL for GA3should be set up as early as possible.

gibberellin A3; acute toxicity; genotoxicity

TS201.6

A

10.7506/spkx1002-6630-201517044

2014-09-18

重庆市科委重点课题（cstc2013yykfB0165）

商桑（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：gksl612susan@yeah.net

*通信作者：丁晓雯（1963—），女，教授，博士，研究方向为食品安全与质量控制。E-mail：xiaowend@sina.com