植物乳杆菌fmb10产细菌素发酵条件的优化

陈芸芸，陆兆新*，卢 静，杨 杰，魏照辉

植物乳杆菌fmb10产细菌素发酵条件的优化

陈芸芸1,2，陆兆新2,*，卢 静2，杨 杰2，魏照辉2

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210000）

通过单因素试验对影响植物乳杆菌fmb10发酵产细菌素的8个影响因子进行初筛，采用Plackett-Burman设计法确定显著影响因子，利用最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域，运用Design-Expert软件的中心组合试验设计（central composite design，CCD）对显著影响因子的重要水平和交互作用进行研究。结果表明，菌株fmb10产细菌素的最佳发酵条件为：发酵温度30.38℃、葡萄糖质量浓度21.1 g/L、酵母膏质量浓度11.0 g/L，在此条件下，植物乳杆菌fmb10发酵上清液对大肠杆菌抑菌圈直径平均为22.90 mm，与预测值22.89 mm高度吻合，优化后植物乳杆菌fmb10发酵上清液抑菌圈直径较原始抑菌圈直径（18.37 mm）提高了24.66%。

植物乳杆菌；细菌素；Plackett-Burman设计；响应面

乳酸菌细菌素已成为天然防腐剂研究与开发应用的热点[1]。它是乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物[2-3]。广谱性乳酸菌细菌素的开发已经成为乳酸菌研究的热点之一[4]，近几年越来越多的抑菌广谱性细菌素被发现[5]。目前已在革兰氏阳性菌中发现50余种羊毛硫细菌素[6]，一部分乳酸菌细菌素已作为天然食品添加剂用于食品保藏以减少化学防腐剂的添加量[7]。

本实验从福建漳州程溪本地特色水果凤梨中筛选得到一株具有广谱抑菌活性的植物乳杆菌fmb10，为提高其植物乳杆菌素产量，对其进行了单因素初筛、Plackett-Burman设计确定显著影响因子、最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域、响应面法的中心组合试验设计（central compositedesign，CCD）对显著影响因子的重要水平和交互作用进行研究，以确定植物乳杆菌fmb10发酵产细菌素的最佳发酵条件，提高细菌素的产量。

1 材料与方法

1.1菌种

供试菌株：分离自福建漳州程溪菠萝，编号fmb10。

指示菌：大肠杆菌（E. coli），南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏。

1.2培养基

乳酸菌活化及筛选采用MRS培养基[8]；指示细菌采用NA培养基[9]。

1.3方法

1.3.1菌种的活化与培养

植物乳杆菌fmb10经传代活化后，以1%接种量接入液体MRS培养基，37℃静置培养24 h[10]。

1.3.2指示菌平板制备及抑菌活性的测定

用移液枪吸取过夜培养的幼龄大肠杆菌1 mL于100 mL NA培养基中（50℃），充分摇匀，静置冷却备用；采用打孔扩散法测定抑菌活性[11]。

1.3.3单因素试验

1.3.3.1 发酵温度

分别设定发酵温度为28、30、35、37、40℃，装液量100 mL/250 mL，发酵24 h。

1.3.3.2初始pH值

用HCl调节培养基初始pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，30℃、装液量100 mL/250 mL，发酵24 h。

1.3.3.3装液量

设定装液量为40、60、80、100、120 mL/250 mL，30℃条件下发酵24 h。

1.3.3.4碳源

分别添加20 g/L的葡萄糖（G）、蔗糖（S）、麦芽糖（M）、乳糖（L），10 g/L G+10 g/L S、10 g/L G+ 10 g/L L、10 g/L G+10 g/L M，37℃，发酵24 h。单一碳源葡萄糖（G）质量浓度分别设为5、10、20、30 g/L，以不添加任何碳源为空白对照。

1.3.3.5氮源

分别添加20 g/L的蛋白胨（PP）、牛肉膏（BE）、酵母膏（Y E）、胰蛋白胨（T P）、柠檬酸三铵（AC），10 g/L YE+2 g/L AC（配方1）、10 g/L YE+10 g/L TP（配方2）、10 g/L YE+10 g/L TP+ 2 g/L AC（配方3）、10 g/L YE+10 g/L TP+5 g/L AC（配方4）、10 g/L YE+10 g/L BE+2 g/L AC（配方5）、10 g/L YE+10 g/L PP+2 g/L AC（配方6）、10 g/L YE+ 10 g/L TP+5 g/L PP+2 g/L AC（配方7），以不添加氮源为空白对照。

1.3.3.6磷酸盐

分别添加2 g/L的Na3PO4、KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO4、NH4H2PO4、(NH4)2HPO4；替换NaH2PO4添加量为1、2、3、4 g/L，以不添加磷酸盐为空白对照。

1.3.3.7金属离子

培养基中分别添加2 g/L的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、MnCl2、CuSO4、FeSO4，发酵24 h，以不添加金属离子为空白对照。

1.3.3.8生长因子

培养基中吐温-80体积分数分别为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，发酵24 h。

1.3.4 Plackett-Burman设计筛选

根据单因素试验结果，采用数据处理软件Minitab 16的Plackett-Burman设计法创建试验次数N=12的试验，对温度、碳源、氮源、磷酸盐、金属离子5个主要因素进行考察，以抑菌圈直径为响应值进行试验各因素主效应分析，考察各因素对fmb10产细菌素影响的显著性。

1.3.5最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验筛选出的显著因子，以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素抑菌圈直径的大小确定变化步长，逼近最佳区域，以建立有效的响应面拟合方程。

1.3.6响应面优化发酵条件模型的建立及其显著性

根据Plackett-Burman试验结果，选出3个显著影响的因素，运用Design-Expert软件的CCD法，每个因素取3个水平，以-1、0、1编码进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方项和交互项的二阶经验模型，分析各因素对fmb10发酵产细菌素活性的主效应和交互效应，确定fmb10产细菌素的最优培养条件。

2 结果与分析

2.1不同发酵条件对植物乳杆菌fmb10发酵产细菌素的影响

图1 不同发酵温度（a）、初始pH值（b）和装液量（c）对fmb10发酵产细菌素的影响Fig.1 Effects of culture temperature (a), initial pH (b) and medium volume (c) on the production of plantaricin

在不同发酵温度、初始pH值及装液量条件下发酵，考察发酵条件对植物乳杆菌fmb10发酵产细菌素的影响，结果见图1。30℃时菌株fmb10的抑菌圈直径最大，这与Ogunbanwo等[12]很多研究一致，在30℃时最有利于植物乳杆菌产细菌素。也有报道某些植物乳杆菌产细菌素的最佳发酵温度较低，Delgado等[13]研究发现，Lactobacillus plantarum17.2b在24℃时抑菌活性最高。初始pH值和装液量对菌株fmb10发酵产细菌素影响不明显，本试验选择初始pH 6.0、装液量100 mL/250 mL为后续研究的发酵条件。

2.2植物乳杆菌fmb10发酵产细菌素的培养基组分优化

2.2.1主要营养成分

图2 不同碳源对fmb10发酵产细菌素的影响Fig.2 Effects of different carbon sources on the production of plantaricin

如图2、3所示，单纯加葡萄糖（G）为碳源，菌株fmb10的抑菌活性明显高于其他碳源，且初始添加量为20 g/L时抑菌活性最大，Matsusaki等[14]研究也报道，Nisin Z类乳酸菌细菌素产生的最适碳源为葡萄糖和蔗糖。

图3 不同质量浓度葡萄糖对fmb10发酵产细菌素的影响Fig.3 Effects of glucose concentration on the production of plantaricin

图4 20 g/L不同单一氮源（a）和复合氮源（b）对fmb10发酵产细菌素的影响Fig.4 Effects of individual and combined nitrogen sources on the production of plantaricin

由图4a、4b可知， 柠檬酸三铵（AC）为氮源时，由于使得最终发酵液体系pH值过高，抑制了菌株fmb10细菌素的产生；而添加20 g/L酵母膏（YE）培养得到的fmb10菌株抑菌活性最高；混合氮源明显比单一氮源更有利于提高菌株fmb10发酵产细菌素，其中以10 g/L YE+10 g/L PP+2 g/L AC的组合抑菌作用最强，说明柠檬酸三铵（AC）作为单一氮源不适合，但作为复合氮源的成分，有重要的pH值缓冲作用，这与鲁渊[15]的分析结果一致。

2.2.2其他成分

磷酸盐的种类和质量浓度对细菌素产量变化有着明显的影响[16]。图5、6结果显示，NaH2PO4对菌株fmb10产细菌素的效果最佳，其质量浓度为2 g/L时菌株fmb10的抑菌活性最大。

图5 不同2 g/L的磷酸盐对fmb10发酵产细菌素的影响Fig.5 Effects of different phosphate sources (2 g/L) on the production of plantaricin

图6 不同质量浓度NaH2PO4对fmb10发酵产细菌素的影响Fig.6 Effects of NaH2PO4concentration on the production of plantaricin

图7 不同2 g/L的金属离子对fmb10发酵产细菌素的影响Fig.7 Effects of different metal ions (2 g/L) on the production of plantaricin

金属离子不仅影响细菌的生长，如Mg2+、Mn2+和Fe2+会明显促进细菌生长[17]，Cu2+具有较强的抑制作用[18]，同时也影响细菌素的发酵生产，极低质量浓度的Ca2+就能促进Nisin的活性提高20%[14]，而Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+的抑制作用最强[19]。由图7可知，Cu2+对菌株fmb10合成细菌素有强烈的抑制作用，而2 g/L Na+可以提高菌株fmb10的抑菌活性，其他金属离子对菌株fmb10细菌素的合成无明显提高作用。

图8 不同体积分数吐温-80对fmb10发酵产细菌素的影响Fig.8 Effects of Tween-80 concentration on the production of plantaricin

适量吐温-80会促进细菌素产生并提高抑菌活性，但过量吐温-80会和硫酸铵反应形成沉淀，导致纯化工艺变复杂[15]。由图8可知，吐温-80可提高细菌素的合成，但随着其体积分数增大到0.5%，抑菌作用开始降低，加之高体积分数吐温-80不利于分离纯化，故选择最适体积分数为0.1%。

2.3 Plackett-Burman设计优化发酵条件

在单因素试验基础上，选择5个对植物乳杆菌fmb10发酵产细菌素有重要作用的因素：发酵温度、葡萄糖质量浓度、酵母膏质量浓度、NaH2PO4质量浓度、NaCl质量浓度，以抑菌圈直径为指标进行Plackett-Burman设计，考察这些因素对fmb10发酵产细菌素的影响，试验因素水平与结果见表1。

Plackett-Burman方差分析和各因素显著性检验结果见表2，对菌株fmb10产细菌素具有显著影响的因子为：X1（P=0.006）、X2（P=0.014）和X3（P=0.015），且均为正效应，说明这3个因素在水平上限时更有利于菌株fmb10产细菌素，符合单因素筛选的试验结果，中心点应适当上移[20]。

表1 Plackett-Burman试验设计与结果Table1 Plackett-Burman design with experimental and predicted values of bacteriostatic diameter

表2 Plackett-Burman设计回归模型方差分析Table2 Analysis of variance of regression model from Table2 Analysis of variance of regression model from Plackett-Burman design sign

2.4最陡爬坡试验接近最大响应面区域

由Plackett-Burman试验的结果选取X1（发酵温度）、X2（葡萄糖质量浓度）和X3（酵母膏质量浓度）这3个显著因素进行最陡爬坡试验，见表3。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table3 Experimental design and results of steepest ascent pathTable3 Experimental design and results of steepest ascent path

由表3可知，最佳因素的条件处于第3组，故以30℃、20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母膏作为后续试验的中心点进行响应面分析。

2.5响应面优化培养条件

2.5.1预测模型建立及显著性检验

通过Plackett-Burman设计筛选出显著影响因子，并通过最陡爬坡试验确定接近响应值区域的因素水平，采用CCD进一步优化，结果见表4。

表4 中心组合试验设计及结果Table4 Central composite design with experimental values of bacteriostatic diameter

利用Design-Expert分析软件对表中数据进行多元回归拟合，得到响应值抑菌圈直径（Y）对自变量X1、X2和X3的二次多项回归方程：

对上述回归模型进行方差分析，结果如表5，该模型达到了极显著水平（P＜0.000 1），回归方程的失拟性（P=0.164 3）检验不显著。回归模型的R2Adj=0.982 8，说明该模型能解释98.28%的变化，决定系数R2=0.992 5，表明菌株fmb10产细菌素抑菌活性的实测值与预测值之间有很好的拟合度。因此，此模型可用于分析和预测菌株fmb10产细菌素的发酵条件。

表5 中心组合试验设计的回归模型方差分析结果Table5 Analysis of variance of regression model from central composite design for bacteriostatic activity of plantaricin

2.5.2发酵条件的响应面分析与优化

由中心组合回归模型得到的响应面图见图9，分别体现了影响菌株fmb10发酵产细菌素的各显著因素间两两交互作用。可以看出，回归方程存在稳定点，通过软件分析，稳定点即最大值点，所对应的各显著因素最佳条件分别为发酵温度30.38℃、葡萄糖质量浓度21.1 g/L、酵母膏质量浓度11.0 g/L，此时fmb10发酵上清液的抑菌活性最高，抑菌圈直径达到22.89 mm。

图9 各因素交互作用对菌株fmb10细菌素合成影响的响应面图Fig.9 Response surface plot showing the interactions of experimental factors on the production of plantaricin

2.5.3验证实验

以发酵温度30℃、葡萄糖质量浓度21.1 g/L、酵母膏质量浓度11.0 g/L，分3批发酵菌株fmb10并测定其发酵上清液的抑菌活性，得到抑菌圈直径分别为23.01、22.93、22.76 mm，平均值为22.90 mm，与预测值22.89 mm非常接近，比原始发酵上清液抑菌圈直径（18.37 mm）提高了24.66%。

3 结 论

本研究在单因素试验的基础上，采用响应面法对菌株fmb10产细菌素发酵条件进行优化，通过Plackett-Burman设计确定发酵温度、葡萄糖质量浓度、酵母膏质量浓度为显著影响因子，利用最陡爬坡试验逼近最佳响应面区域，最终运用Design-Expert软件的中心组合试验设计对显著影响因子的重要水平和交互作用进行了研究，得到主要因子的最佳发酵条件为：发酵温度30.38℃、葡萄糖质量浓度21.1 g/L、酵母膏质量浓度11.0 g/L，在此优化条件下对菌株fmb10进行发酵并测定发酵上清液的抑菌活性，同得到发酵上清液的抑菌圈直径平均值为22.90 mm，比原始发酵上清液抑菌圈直径（18.37 mm）提高了24.66%，与预测值22.89 mm也非常接近，说明回归方程较真实地反映了筛选出的显著因子对菌株fmb10发酵产细菌素的影响，建立的模型与实际情况基本相吻合，采用响应面法优化菌株fmb10发酵产细菌素是有效可行的。

对发酵上清液进行浓缩，并通过有机溶剂萃取、Sephadex LH-20分子筛及Sephadex G-25层析等纯化后测定其抑菌圈大小，结果显示其仍然具有很高的抑菌活性，此优化后的发酵条件为后续将要进行的细菌素分离纯化鉴定工作提供了基础。

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Optimization of Culture Conditions for Plantaricin Produced by Lactobacillus plantarum fmb10

CHEN Yunyun1,2, LU Zhaoxin2,*, LU Jing2, YANG Jie2, WEI Zhaohui2
(1. School of Biological Science and Biotechnology, Minnan Normal University, Zhangzhou 363000, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210000, China)

Influences of 8 factors (including medium components and culture conditions) on the production of plantaricin byLactobacillus plantarumfmb10 were evaluated by Plackett-Burman design to select the most significant factors. Subsequently, the path of steepest ascent design was used to approach the optimal region, followed by the use of central composite design (CCD) and response surface methodology for further optimization of the selected significant factors. Culture temperature, glucose concentration and yeast extract concentration were found to be the factors with the most significant influence on plantaricin production, and their optimum levels were determined as 30.38℃, 21.1 g/L and 11.0 g/L, respectively. Under the optimum conditions, the bacteriostatic diameter of the fermentation supernatant was 22.90 mm, indicating a 24.66%increase compared with that (18.37 mm) obtained before optimization.

Lactobacillus plantarum; plantaricin; Plackett-Burman design; response surface methodology

Q93.331

1002-6630（2015）17-0140-06

10.7506/spkx1002-6630-201517027

2014-09-16

“十二五”国家科技支撑计划项目（2011BAD23B05）

陈芸芸（1978—），女，讲师，硕士，研究方向为食品微生物。E-mail：windy970530@163.com

*通信作者：陆兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：fmb@njau.edu.cn