土党参多糖铁配合物的制备及其理化性质

肖 雄，彭 梅，杨 娟*

（贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002）

土党参多糖铁配合物的制备及其理化性质

肖 雄，彭 梅，杨 娟*

（贵州省、中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550002）

以土党参多糖（Campanumoea javanicapolysaccharide，CJP）和氯化铁（FeCl3）为底物合成土党参多糖铁配合物（CJP-Fe3+）。采用邻菲罗啉分光光度法测定配合物中铁含量，分析配合物的理化性质、稳定性和还原性，通过红外光谱法对其结构进行表征。结果表明：实验制备的CJP-Fe3+为红棕色无定型粉末，铁含量达到22.81%；定性鉴定结果表明CJP-Fe3+中不存在游离的Fe3+，稳定性实验结果显示CJP与Fe3+形成了稳定的配合物，在空气中不易分解。CJP-Fe3+在pH 3～12范围内可以稳定存在，在此酸碱度范围内配合物结构不会被破坏。CJP-Fe3+有望被开发为新型的补铁剂。

土党参多糖铁配合物；理化性质；补铁剂

土党参为桔梗科金钱豹属植物金钱豹（Campanumoea javanicaBl. subsp. japonica（Makino）Hong），民间以其根入药，常用来炖鸡、炖瘦肉等，具有补气、止血、通乳等作用[1]。土党参多糖（Campanumoea javanicapolysaccharide，CJP）由本课题组从土党参根中提取得到，在土党参中含量丰富且具有多种生物活性[2-5]。近年来不少学者利用生物多糖与铁配合生成多糖铁复合物，作为补铁剂来治疗缺铁性贫血症。许多以中药或食品所含多糖作为配体的多糖铁复合物如当归多糖铁[6]、香菇多糖铁[7]、玉竹多糖铁[8]、茶叶多糖铁[9]、孔石莼多糖铁[10]等见于报道。与传统的补铁剂相比，多糖铁配合物具有稳定的高水溶性，能以分子形式被吸收，吸收率与硫酸亚铁相当。无铁离子存在，对胃肠黏膜无损害，补铁剂在十二指肠被吸收且呈稳定的可溶状态。多糖铁具有很强的还原性，可被体内还原性物质（如VC等）还原成Fe2+吸收利用，符合理想补铁剂的特点[11-16]。多糖铁复合物具有很好的临床疗效，且不良反应少[17-20]。本实验用土党参多糖与氯化铁（FeCl3）合成了土党参多糖铁配合物，分析了其含铁量、稳定性、理化性质，用红外光谱初步分析了土党参多糖铁配合物的结构特点，为土党参多糖铁配合物作为新型补铁剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

土党参多糖（CJP）由本课题组从桔梗科金钱豹属植物金钱豹（Campanumoea javanica）Bl.的根中提取得到。糖含量≥95%，分子质量2 900 D，为β-(2→1)-果聚糖。

透析袋（截留分子质量1 000 D） 上海绿鸟科技发展有限公司；FeCl3、K4[Fe(CN)6]、(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O、柠檬酸钠、NaOH、无水乙醇、邻菲罗啉、抗坏血酸、盐酸羟胺等为国产分析纯。

1.2仪器与设备

BUCHI-R220旋转蒸发仪 美国GE公司；DZF-6021真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；C-MAG HS7磁力加热搅拌器 德国IKA公司；AG285电子分析天平 瑞士Mettler-Toledo公司；TDL-40C低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；8453型紫外-可见分光光度计 美国惠普公司；FT-IR Vector-22傅里叶红外光谱仪 德国Bruker公司。

1.3方法

1.3.1土党参多糖铁配合物的制备[21]

取100 mg干燥土党参多糖（CJP）、500 mg柠檬酸钠，混合加入到100 mL反应瓶中，加60 mL蒸馏水溶解，在70℃水浴中持续搅拌，同时缓缓滴加质量分数20%的NaOH溶液和2 mol/L的FeCl3溶液，控制二者的滴速并不断检测反应体系的pH值，使pH值始终维持在8.0～9.0左右。当反应液中刚好有不溶的红棕色沉淀生成，立即停止滴加FeCl3和NaOH溶液，继续搅拌反应1 h后趁热4 000 r/min离心15 min，收集红棕色的上清液，加3倍体积的无水乙醇搅拌均匀后，静置24 h。离心收集沉淀并用蒸馏水溶解，加入到截留分子质量为1 000 D的透析袋中，流水透析24 h后再用蒸馏水透析24 h，减压浓缩，60℃真空干燥后得红褐色的土党参多糖铁配合物（CJP-Fe3+）。

1.3.2 CJP-Fe3+中铁含量的测定

采用邻菲罗啉比色法对CJP-Fe3+中铁含量进行测定[22]。精密称取0.702 3 g (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O用少量纯水溶解，加3.0 mL HCl，蒸馏水定容至1.0 L，得100 mg/L的Fe2+溶液，冷藏备用。取10 mL该溶液定容至100 mL，配制成10 mg/L的标准Fe2+溶液（现配现用）。

铁含量标准曲线的绘制：精密量取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.5、3.0 mL Fe2+标准溶液，加入2.0 mL 10%抗坏血酸溶液和2.5 mL 0.1%的邻菲罗啉溶液，用蒸馏水稀释至10 mL，混合均匀后在37℃反应10 min，以蒸馏水加试剂溶液为空白，在510 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，Fe2+的质量浓度为横坐标，在软件上做出标准曲线。

CJP-Fe3+中铁含量的测定：精密称取3份CJP-Fe3+样品20.0 mg置于25 mL（V1）容量瓶中，用蒸馏水溶解，定容至刻度，量取样品溶液1.0 mL（V）至带刻度试管中，加入10%抗坏血酸溶液2.0 mL和0.1%的邻菲罗啉溶液2.5 mL，用蒸馏水定容至10 mL（V2），混合均匀后37℃静置1.0 h，然后在510 nm波长处测定样品溶液吸光度，将结果代入铁含量标准曲线，计算出CJP-Fe2+中Fe2+的质量浓度ρ（mg/mL），按照下式计算CJP-Fe3+中铁含量（S）。

式中：m为CJP-Fe3+样品的质量/mg。

1.3.3 CJP-Fe3+的结构分析

红外光谱分析：采用KBr压片法，将完全干燥的CJP-Fe3+样品与KBr按照1∶100（m/m）的比例混合，研磨成粉末状后压片，于红外光谱仪上对样品进行扫描，以空气为空白吸收，扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.3.4 CJP-Fe3+的定性鉴定

CJP-Fe3+是在碱性条件下由土党参多糖和FeCl3合成制备的，在此条件下，Fe(OH)3的生成是难以避免的，为了进一步确定生成的红棕色粉末是多糖铁配合物而非Fe(OH)3沉淀，参考2010版《中华人民共和国药典（二部）》[23]中高价铁盐的鉴别方法，将合成得到的CJP-Fe3+和Fe(OH)3进行定性比较。

CJP-Fe3+溶液的配制：称取干燥的红棕色样品粉末适量，加50 mL蒸馏水充分溶解，即得到CJP-Fe3+溶液。

Fe(OH)3溶胶的制备：将饱和FeCl3溶液滴加到50 mL沸水中，直至溶液变为红褐色，得到Fe(OH)3溶胶。

分别量取CJP-Fe3+溶液和Fe(OH)3溶胶2 mL于试管中，观察两种溶液是否有丁达尔现象；加入3倍体积95%乙醇，观察是否有醇沉现象；分别在两支试管中加入NaOH、K4[Fe(CN)6]、KSCN溶液，观察是否有沉淀产生。

1.3.5 CJP-Fe3+的稳定性实验

将透析除盐后的CJP-Fe3+溶于水，观察加入K4[Fe(CN)6]后，水浴加热至沸腾过程中，CJP-Fe3+溶液的颜色变化。

1.3.6 CJP-Fe3+的水解实验

配制0.01 mg/mL的CJP-Fe3+溶液，用NaOH和HCl调节溶液的pH值，观察CJP-Fe3+溶液变化情况。

1.3.7 CJP-Fe3+的还原性实验

采用邻菲罗啉比色法对CJP-Fe3+进行还原性实验。配制Fe3+浓度为1.0 mmol/L的CJP-Fe3+溶液50 mL，分别量取CJP-Fe3+溶液5.0 mL于8个50 mL的容量瓶里，分别加NaOH溶液和HCl溶液，使溶液的pH值分别为1、2、3、4、5、6、7、8，然后分别依次加入10%抗坏血酸2.0 mL、0.1%邻菲罗啉3.0 mL，定容至刻度，恒温37℃水浴还原，然后每隔0.5 h取不同pH值条件下的反应液5.0 mL，在510 nm波长处测定吸光度，以不加CJP-Fe3+溶液为空白组。

2 结果与分析

2.1 CJP-Fe3+中的铁含量

以Fe2+的质量浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A510nm）为纵坐标，得到标准曲线的回归方程y＝197.93x-0.003 8（R2＝0.999 6）。在实验所设定的Fe2+质量浓度范围内线性关系良好，根据铁含量计算公式，平行3次实验，得到样品的平均铁含量为22.81%。结果表明邻菲罗啉比色法测定CJP-Fe3+中的铁含量具有操作简单、结果稳定、误差小的优点。

2.2 CJP-Fe3+结构分析结果

图1 CJP（A）和CJP--ee3+（B）红外光谱图Fig.1 IR spectra of CJP (A) and CJP-Fe3+(B)

对CJP与CJP-Fe3+的红外光谱进行比较。如图1所示，CJP-Fe3+在865 cm-1和639 cm-1处的特征吸收峰与文献[24]报道的β-FeOOH的特征吸收峰数据一致，说明CJP-Fe3+中铁核是聚合的β-FeOOH结构。1 622 cm-1处为多糖内H—OH的吸收峰，此处的吸收峰明显增强，说明多糖的—OH参与了络合反应。在1 033 cm-1处的C—O—C伸缩振动及指纹区900～600 cm-1范围内的峰形发生了变化，是多糖与铁形成配合物所引起的。土党参多糖与金属离子络合并没有使多糖的结构发生改变，保留了多糖原来的特征吸收峰，3 422 cm-1处是多糖分子中O—H的伸缩振动吸收峰，2 926 cm-1处是多糖分子中C—H键[25]。红外光谱图显示，土党参多糖与FeCl3反应，形成了CJP-Fe3+。

2.3 CJP-Fe3+的定性鉴定结果

观察结果显示，合成所得产物是一种土党参多糖与铁的络合物，而非Fe(OH)3沉淀，定性鉴定结果见表1。CJP-Fe3+溶液与Fe(OH)3溶胶的定性鉴定实验现象有很大的区别，CJP-Fe3+溶液中没有检测到游离的Fe3+，而是生成了稳定的配合物，说明CJP-Fe3+的结构修饰是成功的。定性鉴定实验结果充分说明了CJP-Fe3+和Fe(OH)3是完全不同的两种物质。

表1 CJP--Fe3+定性鉴定实验结果Table1 Qualitative identification of CJP-Fe3+

2.4 CJP-Fe3+的稳定性

CJP-Fe3+为红棕色无定形粉末，易在水中溶解，而不溶于一般有机溶剂。透析除盐后的CJP-Fe3+样品溶于蒸馏水中，用K4[Fe(CN)6]对其水溶液进行检测，结果未出现Fe3+的特殊反应现象，说明CJP-Fe3+形成了稳定的多糖铁配合物，没有游离的Fe3+存在，并且将CJP-Fe3+粉末长期（＞48 h）放置空气中，用K4[Fe(CN)6]对其水溶液进行检测，也未出现Fe3+的特殊反应现象，说明CJP-Fe3+形成了稳定的多糖铁配合物。

2.5 CJP-Fe3+的水解性

配制0.01 mg/mL的CJP-Fe3+溶液，用NaOH溶液和HCl溶液调节溶液的pH值。在CJP-Fe3+溶液中滴加NaOH溶液，当溶液pH值达到12时，没有混浊现象发生，继续缓缓滴加NaOH溶液，有红棕色沉淀生成，随着pH值的不断增大，沉淀增多。向CJP-Fe3+溶液中滴加HCl溶液，当溶液pH值降到3时，没有混浊现象发生，继续缓缓滴加HCl溶液，溶液中就会有少量的沉淀生成，随着pH值的不断减小，沉淀增多。结果表明，CJP-Fe3+在pH 3～12范围内可以稳定存在。在pH≥12或者pH≤3时，CJP-Fe3+的结构被破坏，生成沉淀。

2.6 CJP-Fe3+的还原性

图2 CJP--FFee3+被抗坏血酸还原的反应曲线Fig.2 Reduction curves of CJP-Fe3+by ascorbic acid

采用邻菲罗啉比色法对CJP-Fe3+进行还原性实验，测得不同pH值条件下各个时间点溶液的吸光度。由图2可知，CJP-Fe3+中的铁可以被抗坏血酸还原，而且A510nm在反应0.5 h时即趋于稳定，说明CJP-Fe3+中的Fe3+在0.5 h左右可以全部被还原成Fe2+。

3 结 论

以土党参多糖和FeCl3为底物合成土党参多糖铁配合物，铁含量可达到22.81%。评价补铁剂生物利用度高低的主要指标之一是补铁剂在机体中铁的主要吸收部位——十二指肠（生理pH 6～7）中是否可溶[13]。CJP-Fe3+在pH 3～12范围内均可溶且能够稳定存在，配合物结构不会被破坏，说明其具有较高的生物利用度。定性鉴定结果表明CJP-Fe3+中不存在游离的Fe3+。稳定性实验结果显示CJP与Fe3+形成了稳定的配合物，在空气中不易分解，因而土党参多糖铁应有较好的生物利用度，有望成为具有开发前景的生物活性补铁剂。

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Preparation and Physicochemical Characterization of Campanumoea javanica Polysaccharides-Iron (Ⅲ) Complex

XIAO Xiong, PENG Mei, YANG Juan*(Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, China)

In this experiment,Campanumoea javanicapolysaccharide-iron (Ⅲ) complexes (CJP-Fe3+) were synthesized withCampanumoea javanicapolysaccharide and ferric chloride as substrates. The iron content of the complex was measuredby phenanthroline spectrophotometry and physiochemical properties, stability and reducing power were also investigated.Its structural characteristics were analyzed by infrared (IR) spectroscopy. The CJP-Fe3+complexes were obtained as a redbrown amorphous powder with an iron content of 22.81%. Qualitative identification experiments showed that there was nofree Fe3+detectedin CJP-Fe3+complexes. The complex was stable in the air and within a broad pH range from 3 to 12; thestructure of this complex in this pH range was not destroyed. Thus, CJP-Fe3+can be developed as a new iron supplementary.

Campanumoea javanicapolysaccharides-Fe3+complex; physicochemical properties; iron supplementary

R284. 3

1002-6630（2015）17-0013-04

10.7506/spkx1002-6630-201517003

2014-10-29

国家自然科学基金地区科学基金项目（81160513）

肖雄（1988—），男，硕士研究生，主要从事天然产物提取分离与活性研究。E-mail：382310002@qq.com

*通信作者：杨娟（1971—），女，研究员，博士，主要从事天然活性成分研究。E-mail：yangxz2002@126.com