石榴籽油的微胶囊化研究

2015-01-03 08:06刘立志郭婵娟范智义汪晓坤刘邻渭
中国粮油学报 2015年2期
关键词:籽油微胶囊石榴

刘立志 郭婵娟 范智义 汪晓坤 薛 培 刘邻渭

(西北农林科技大学食品科学与工程学院,杨凌 712100)

石榴籽油的微胶囊化研究

刘立志 郭婵娟 范智义 汪晓坤 薛 培 刘邻渭

(西北农林科技大学食品科学与工程学院,杨凌 712100)

以陕西临潼酸石榴为试验原料,探讨利用干酵母细胞作为壁材包埋石榴籽油制备微胶囊的可行性。通过正交试验研究芯材比、包埋温度、包埋时间对包埋率的影响并优化微囊化工艺,通过显微观察研究包有石榴籽油的酵母细胞的内外形态,通过理化分析研究微胶囊化前后石榴籽油脂肪酸组成的区别和它们在60℃加速氧化条件下的稳定性差异。在芯材比1∶1、包埋温度70℃、包埋时间4 h的条件下,石榴籽油的包埋率达到53.35%。光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察显示,包埋石榴籽油的酵母细胞更加饱满,表面光滑、平整、无油滴,细胞器结构发生明显变化,质壁发生分离。GC-MS分析表明,包埋前后石榴籽油的脂肪酸组成无明显变化;在储藏过程中,微胶囊化的石榴籽油的稳定性比对照明显提高。总之,采用该工艺微胶囊化石榴籽油,可有效提高其储存稳定性,产品具有酵母外形、流动性良好、食用安全性高,值得进一步发展。

石榴籽油 干酵母 微胶囊 显微结构 储存稳定性

石榴(Punica granatum L.)又名安石榴、若榴、丹榴、天浆及金罂等,属于石榴科石榴属落叶灌木或者小乔木,我国南北各地均有种植,分布广泛。有研究发现,石榴籽含油量高达50.9%,多为不饱和脂肪酸,其中石榴酸在石榴籽油中约占86%,因其含有共轭三烯结构,性质十分活泼,是一种非常独特的天然抗氧化剂。

药力学研究证明,石榴籽油及提取物具有抵抗炎症和氧自由基对人体的损伤、延缓衰老、预防动脉粥样硬化、防治乳腺癌、降血糖、抗腹泻等作用[1-4]。

石榴籽油中含有丰富的不饱和脂肪酸,因此在加工、储藏和使用过程中易受空气、光照、酶及金属离子等的作用而发生自动氧化反应,导致酸败变质。所以,如何防止石榴籽油在食品加工及贮藏过程中氧化酸败是一个不容忽视的问题。

微胶囊是一种具有聚合物壁壳(或外膜)的微型包装物。微胶囊技术可以将需要保护的固体、液体或气体(称为囊芯)包埋和固化在囊壁中,从而使芯材物质免受外部环境的影响,降低挥发性,提高稳定性。

微胶囊的制备方法通常包括化学法、物理法和物理化学法3类共20余种。这些方法一般存在制备过程复杂、工艺条件控制精度要求高、成本高、产品质量稳定差以及理想的囊壁材料有限等局限性。20世纪70年代,Shank发明了利用酵母细胞作为天然囊壁材料制备微胶囊的技术[5-6]。由于酵母价格低廉、细胞呈球形或椭球形,以分散的单细胞状态存在,直径在几微米到20μm范围,完整的细胞壁和细胞膜结构具有一定的强度和通透性,是理想的囊壁材料。

与传统的微胶囊制备方法相比,以酵母细胞为囊壁材料制备微胶囊具有以下优势[7-8]:制备过程中,不需要或很少引入其他化学试剂,较少溶剂残留或脱除的问题,非常适合药物和食品添加剂的包覆。该技术获得的微胶囊产品大小均一、无毒、生物相容性好、易生物降解,因此给食品工业和医药业微胶囊化技术带来了新的进展。目前国内已有采用酵母细胞对丁香油、冬青油、杏仁油等包埋的研究报道[9-11],但利用酵母细胞对石榴籽油微胶囊化的研究鲜见报道。

本研究探讨以干酵母细胞作为囊材制备石榴籽油微胶囊的可行性,优化酵母对石榴籽油微胶囊化技术中的芯材比、包埋温度、包埋时间等技术条件,初步获得包埋率、表观性状和稳定性较高的石榴籽油微胶囊。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活性干酵母(啤酒专用酵母、酿酒专用酵母、面包专用酵母):湖北安琪酵母股份有限公司;酸石榴:陕西临潼;石油醚(沸程30~60℃)、石油醚(沸程60~90℃):分析纯,天津博迪化工股份有限公司;苯:分析纯,成都科龙化工试剂厂;甲醇:分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇:分析纯,四川西號化工有限公司;辣椒红素150E:益阳市金大地天然色素有限公司;伦敦白胶(LR White):上海桑戈生物科技有限公司;0.45μm有机系针式微滤膜滤头:杭州赛析科技有限公司。

1.2 仪器

XHF-D高速分散器(内切式匀浆机):宁波新芝生物科技有限公司;BL3-120A超声波清洗机:上海比朗仪器有限公司;SFA-C水浴恒温振荡器:常州国华电器有限公司;TSQ-280恒温振荡器:上海精宏实验设备有限公司;7230可见分光光度计:上海精科实验仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器厂;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵:郑州城科工贸有限公司;KDC-40低速离心机:科大创新股份有限公司中佳分公司;DZF真空干燥箱:北京科伟永兴仪器有限公司;JEOL-1230透射电子显微镜、JSM-6360LV扫描电镜:日本电子公司;BX51+DP70显微镜:日本奥林巴斯公司;GCMS-QP2010气相色谱质谱联用仪:日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 石榴籽的处理

洗净石榴籽上残余的果肉,沥干水分后,置于不锈钢盘中,在50℃下烘干,粉碎后过60目筛,收集过筛后的原料(石榴籽粉),装瓶备用。

1.3.2 石榴籽油的浸提

浸提工艺流程:石榴籽→清洗、烘干→粉碎→过筛→超声波浸提→料液分离(过滤)→滤液旋转蒸发→石榴籽油

准确称取石榴籽粉与石油醚(沸程60~90℃)按1∶10的比例充分混于250 mL磨口烧瓶中,然后置于超声波清洗器内,在40℃下浸提60 min。提取结束后,过滤分离溶剂与残渣,残渣用石油醚洗涤2~3次,合并滤液,在旋转蒸发器上减压蒸馏,回收溶剂,得到的石榴籽油和残余溶剂混合物,转移至已称重的烧杯,在105℃下干燥至恒重得到石榴籽油。

1.3.3 干酵母的预处理

将啤酒、酿酒、面包专用干酵母经105℃灭活1 h,放凉后装瓶备用。

1.3.4 石榴籽油微胶囊的制备

1.3.4.1 制备步骤

准确称取灭活的啤酒干酵母适量,按约1∶8的比例加水分散,按试验设计的不同芯材比加入石榴籽油,用高速剪切分散器于8 000 r/min乳化均质6 s,转入250 mL磨口烧瓶中。放入恒温水浴振荡器中,恒温恒速(100 r/min)振荡一定时间后,石榴籽油即可通过渗透扩散作用进入酵母细胞内部,形成微胶囊。

取出磨口烧瓶,加入等体积的80%的乙醇溶液,搅拌均匀,静置30 min,除去上清液,将沉淀于600 r/min离心分离10 min,离心沉淀物经真空抽滤并用无水乙醇洗净表面残留的石榴籽油,60℃真空干燥24 h,得到石榴籽油微胶囊。

1.3.4.2 工艺参数优化

通过L934正交试验设计(见表1),探究包埋芯材比、包埋温度和包埋时间3个因素对石榴籽油包埋率的影响并优化最佳工艺参数。

表1 正交试验因素水平表

1.3.5 包埋率的测定

称取5 g左右石榴籽油微胶囊,采用石油醚超声波辅助提取法提取出其中包埋的石榴籽油,称重。

石榴籽油微胶囊包埋率按下式计算:

石榴籽油微胶囊包埋率=(m1/m2)×100%

式中:m1为提取的石榴籽油质量/g;m2为加入的微胶囊质量/g。

1.3.6 微胶囊化前后石榴籽油的GC-MS分析

1.3.6.1 石榴籽油的甲酯化处理

准确称取30 mg油样,置于具塞试管中,加入2 mL石油醚(沸程 30~60℃)与苯(1∶1,V/V)混合液,振荡使油脂溶解,加入1 mL 0.4 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液,混匀后于室温下静置5 min,再加入12 mL水,静置后用注射器吸取上层溶液,并经0.45 μm有机系微孔滤膜头过滤后装入1.5 mL色谱样品瓶。

1.3.6.2 GC-MS分析条件

气相色谱条件:rxi-5ms(30.0 m×0.25 mm)色谱柱;程序升温由120℃以8℃/min升至220℃,然后以5℃/min升至280℃,保持5 min;载气 He;载气过柱流量1 mL/min;进样口温度250℃;进样量1μL;分流比:80∶1。质谱条件:EI离子源;辅助加热200℃;扫描范围50~450 m/z。

1.3.7 休止角的测定

采用GB 11986—1989方法。

1.3.8 石榴籽油微胶囊的形态结构观察

1.3.8.1 光学显微镜观察

分别取少量灭活干酵母和石榴籽油微胶囊粉末,分别在蒸馏水中分散,制成菌悬浮液,各取一滴制成水浸片,在光学显微镜下观察其形态。

1.3.8.2 扫描电镜观察

扫描电镜样品台上贴上双面胶,分别撒少许灭活干酵母与石榴籽油微胶囊粉末,吹去多余的粉末,喷金后用扫描电镜观察其形貌,加速电压为20 kV。

1.3.8.3 透射电镜观察

分别将灭活干酵母和石榴籽油微胶囊用4%的戊二醛固定6 h以上,采用0.1 mol/L,pH 6.8的磷酸缓冲液(PBS)进行冲洗,5、10、15、20、25、30 min各冲洗1次,然后在4℃下用1%锇酸固定2 h。再用0.1 mol/L,pH 6.8的磷酸缓冲液(PBS)进行冲洗,5、10、15、20、25、30 min各冲洗 1次。接着用 30%、50%、70%、80%、90%的乙醇各洗1次,每次15 min,最后用100%的乙醇脱水2次,每次30 min。采用白胶包埋剂与无水乙醇(按1∶1体积混合)渗透过夜;然后再用纯白胶渗透2次,第1次2 h,第2次1 h。完成纯白胶包埋,再置于60℃的烘箱烘干,烘干时间为48 h。抠出胶粒,经修块和超薄切片,用JEOL-1230透射电镜观察石榴籽油微胶囊结构,定位摄影,加速电压为80 kV。

1.3.9 石榴籽油微胶囊的体外抗氧化试验

采用 Schaal烘箱法(60±1)℃[12],分别取适量石榴籽油和石榴籽油微胶囊,在烘箱内于(60±1)℃,分别敞口放置,定时取出一定量石榴籽油和石榴籽油微胶囊,用石油醚(沸程30~60℃)充分提取微胶囊中包埋的石榴籽油并于70℃挥去石油醚。称取相同质量的这两种油,测定过氧化值,根据10 d内定时测定结果而汇成的过氧化值变化曲线,分析对比它们的耐氧化性能。根据Arrhenius经验公式,Schaal烘箱法的1 d相当于室温下1个月的货架寿命,因此可初评微胶囊的保质效果。

1.3.10 过氧化值(POV)测定

采用GB/T 5009.37—2003过氧化值测定法进行测定。

2 结果与分析

2.1 石榴籽油微胶囊制品的包埋率及影响因素分析

正交试验的结果如表2所示,其方差分析结果如表3所示。极差分析和方差分析结果:包埋温度对包埋效果的影响最大。随着包埋温度的升高,微胶囊中石榴籽油的包埋率也随之增大,各水平间差异达到5%的显著水平。温度升高,一方面,加快分子运动速度,促进石榴籽油向酵母细胞内部扩散;另一方面,可能会导致酵母细胞壁和细胞膜上蛋白质的变性和一些脂溶性物质的溶解,使细胞壁和细胞膜的通透性增加,这些作用使石榴籽油包埋率增大。芯材比对包埋效果影响不显著但有影响,而包埋时间对包埋效果的影响不显著。总之,各个因素对石榴籽油包埋率的影响顺序为:包埋温度>芯材比>包埋时间。

极差分析说明,包埋温度的最优水平为A3;芯材比最优水平为C2。极差分析和方差分析都说明包埋时间的改变对包埋率只有微弱影响,因此,从经济性和对石榴酸的保护角度考虑,选包埋时间的最优水平为B1。所以,在实验范围内各因素的最佳组合为A3B1C2,即包埋温度70℃、包埋时间4 h、芯材比为 1 g/g。

正交试验结果提示,继续提高包埋温度可能还会提高包埋率,而包埋率越高,在实际应用中越有价值,但是,包埋温度并不是越高越好,因为包埋温度过高,酵母细胞会解体,实际可纳入的石榴籽油又会流失。同时,由于在长时间高温条件下进行,可能会造成石榴籽油中的不饱和脂肪酸发生氧化,影响其生物活性,因此没有进一步提高包埋温度。

表2 正交试验方案及结果

表3 正交试验结果方差分析

取石榴籽油,采用啤酒酵母按最佳工艺方法进行3次包埋验证试验,获得的微胶囊包埋率平均结果是53.35%,略高于正交试验最大值(9号)。

2.2 不同种类酵母包埋率的比较

为了充分利用废弃酵母资源,试验研究了啤酒酵母、酿酒酵母以及面包酵母对石榴籽油包埋效果的差异,结果如图1所示。

图1 不同种类酵母的包埋率

从图1可以看出:由于3种酵母细胞对石榴籽油的吸附能力不同,酿酒酵母相比其他两种酵母对石榴籽油的包埋效果好,但三者之间差别不显著。所以,在工业生产中可以利用不同种类的废弃干酵母混合物作为壁材;由于在制备微胶囊前须将干酵母进行灭活处理,所以只要求酵母细胞结构完整而其是否存在活性均可利用。可见,在生产中可将工厂的废弃酵母回收利用,降低原料成本,容易实现工业化生产。

2.3 石榴籽油微胶囊形貌观察与分析

从酵母细胞及石榴籽油微胶囊的光学显微镜照片(见图2)中可看出:与灭活干酵母细胞相比,石榴籽油微胶囊体积有所膨胀,但颗粒完整,表面光滑、平整、无明显油滴。

灭活干酵母细胞和石榴籽油微胶囊在扫描电镜下的微观形貌如图3所示。可以看出:未包埋石榴籽油的酵母细胞干瘪,细胞碎片多。而石榴籽油微胶囊颗粒完整、碎片少(这可能由于低速离心分离微胶囊化酵母时,碎片保留在上清液中而被分离除去),细胞饱满,表面光滑、致密、无孔隙,粒径分布均匀,在4μm左右。

图4是通过透射电镜得到的酵母细胞及石榴籽油微胶囊的电子衍射图。从图4能够看出:灭活干酵母细胞清晰、完好,细胞核结构明显,细胞器外形完整,原生质紧贴于细胞壁,细胞壁外可观察到胞外多糖。相比之下,石榴籽油微胶囊已无清晰的细胞内部结构,这可能是由于石榴籽油与细胞器膜相互作用,使细胞器结构受到破坏,部分细胞原生质与细胞壁产生明显分离,但细胞壁仍能保持相对完整,细胞膜层变厚,推测是细胞膜上的磷脂和蛋白吸附石榴籽油后的结果。

图2 酵母细胞及石榴籽油微胶囊的显微图像(×600)

图3 干酵母细胞及石榴籽油微胶囊扫描电镜照片(×2 000)

图4 干酵母细胞及石榴籽油微胶囊透射电镜照片

2.4 石榴籽油微胶囊流动性

食品粉末的流动性决定了它们的输送、筛选、干燥等工艺特性,也影响它们和其他食料混合均匀的难易。休止角和流动性呈负相关,一般来说,休止角在30°以下则粉体流动性好,30°~45°表明粉末流动性较好,45°~60°表明流动性一般,而高于60°表明流动性差[14]。本研究制备的石榴籽油微胶囊的休止角为37.59°,流动性较好,而灭活干酵母的休止角为42.79°。因此,石榴籽油微胶囊流动性较好且优于灭活干酵母。

2.5 微胶囊化过程中对石榴籽油稳定性的影响

为了考察微胶囊化过程中对石榴籽油稳定性的影响,采用超声波辅助法萃取出最优工艺条件下微胶囊包埋的石榴籽油,利用GC-MS对微胶囊化前后的石榴籽油的化学组成和含量进行分析,结果如表4所示。从表4可看出:最佳工艺下制备微胶囊过程中石榴籽油的化学组成没有发生明显变化,主要成分石榴酸的含量略微降低且产生了γ-亚麻酸等。这可能是在微胶囊过程中石榴酸发生少量异构化和氧化,导致亚麻酸、γ-亚麻酸、油酸、亚油酸、十八碳烯酸和硬脂酸的含量上升但不显著。因此,采用现有工艺条件制备微胶囊,对石榴籽油的稳定性影响很小。

表4 微胶囊化前后及储藏前后石榴籽油脂肪酸成分含量分析

2.6 微胶囊化石榴籽油的储藏稳定性

2.6.1 微胶囊石榴籽油在储藏中的耐氧化性

油脂的过氧化值是衡量脂肪酸败程度的重要指标。将石榴籽油微胶囊与未微胶囊化处理的石榴籽油在(60±1)℃培养箱中进行加速氧化试验,其结果如图5所示。

由图5可见,试验起始,微胶囊化石榴籽油的过氧化值比未微胶囊化的石榴籽油高,这是因为微胶囊化过程中石榴籽油已经过70℃下振荡4 h且60℃干燥24 h,因而石榴籽油已发生部分氧化而致。随后,未微胶囊化的石榴籽油的过氧化值急速增加,而石榴籽油微胶囊的过氧化值增加速度一直比较缓慢。这是因为,石榴籽油中的不饱和脂肪酸含量很高,在高温和氧的作用下,未微胶囊化的石榴籽油发生自动氧化和裂解,而石榴籽油微胶囊在酵母细胞膜壁的保护作用下,一方面有效地阻止了氧气的渗透,防止自由基的产生;另外一方面石榴籽油与细胞膜及细胞器膜紧密结合,也有提高其抗氧化的作用。所以,干酵母细胞微胶囊化处理显著地延长石榴籽油的保质期。

图5 微囊化前后石榴籽油在(60±1)℃时过氧化值的变化

2.6.2 微胶囊石榴籽油的脂肪酸在储藏中的变化

为研究未微胶囊化的石榴籽油以及微胶囊化的石榴籽油在(60±1)℃环境中储存10 d后脂肪酸的变化情况,采用GC-MS对其成分和含量进行分析,结果如表4所示。将A样与C样比较可知,未微胶囊化的石榴籽油储存后组成成分和含量变化显著,其中一部分石榴酸发生异构化和较严重氧化,致使亚麻酸、γ-亚麻酸的含量增加,石榴酸含量降低,同时γ-亚麻酸发生氧化和裂解,生成反,反-2,4-十二碳二烯醛氧化产物,说明石榴籽油不稳定易变质,有必要进行微胶囊化保护。将B样与D样相比可知,微胶囊化的石榴籽油脂肪酸组成及含量变化不大,其主要成分石榴酸基本没变化且未检测出氧化产物,这与储藏过程中过氧化值的变化规律相符,二者共同说明石榴籽油经微胶囊化处理稳定性显著增强。

3 讨论

本研究在对干酵母细胞包埋石榴籽油的工艺中,有些问题已经解决,比如:1)使用灭活的酵母细胞比活细胞性质稳定,而且部分加大其细胞壁和细胞膜的通透性;2)使用高速分散器可将水、灭活干酵母和石榴籽油在一定条件下乳化成均质体系,从而有利于石榴籽油以油乳滴的形式扩散渗入被水溶胀的灭活酵母细胞中;3)在本试验条件范围内,优化了芯材与壁材比和油乳滴扩散渗入灭活酵母的温度等条件;4)初步确定了石榴籽油酵母细胞微胶囊的微观结构以及石榴籽油在其中的分布。但有些问题虽然观察到了,也只是有限解决了,比如:1)根据试验摸索,用XHF-D高速分散器的1号剪切头,于8 000 r/min乳化均质6 s这个条件可获得相对最佳的水-灭活干酵母-石榴籽油均质体系。过小转速和过短均质时间不能使油滴稳定分散成大小适当的乳滴,因而不易接触和扩散进入酵母细胞,结果包埋率明显降低;过大转速和过长均质时间可能会造成酵母细胞受到过渡剪切,完整性降低。因此,虽然油乳滴更容易进入细胞内部,但在清洗细胞表面吸附的油时,细胞内部的油也被同时大量洗出,结果包埋率也明显降低。然而,这一最佳均质条件只是在现有设备条件下的适宜条件,换个均质机可能会出现问题。因此,必需进一步研究最佳乳化均质条件下乳滴的尺寸分布范围和酵母细胞的微观结构,才能最终确定最佳乳化均质要求和工艺参数;2)制备微胶囊的技术中使用灭活干酵母这个低成本环保材料,并且有一定营养,可解决发酵工业的废弃酵母利用问题。但制备过程中也使用了一定量乙醇,需要通过回收而反复使用,降低这一成本;3)本研究最佳工艺所得的石榴籽油包埋率(53.35%)虽然比采用酵母细胞包埋丁香油、冬青油和杏仁油的包埋率都高[9-11],但与喷雾干燥法包埋石榴籽油的包埋率[13]还有较大差距,需要进一步研究加以提高。

4 结论

4.1 利用灭活干酵母细胞作为囊壁材料包埋石榴籽油具有可行性,在包埋温度70℃,包埋时间4 h,芯材比为1∶1工艺条件下制备的微胶囊包埋率可达53.35%。

4.2 石榴籽油微胶囊的酵母细胞饱满,表面光滑、无油滴、致密、无孔隙,粒径分布均匀,在4μm左右;在细胞膜和细胞器膜上能观察到油层,无明显细胞器结构,质壁发生分离。

4.3 采用最佳工艺条件制得的微胶囊,对石榴籽油的稳定性影响很小。在(60±1)℃的储藏环境中,该微胶囊中的石榴籽油的稳定性显著高于未经微胶囊化的石榴籽油。

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Microencapsulation of Pomegranate Seed Oil

Liu Lizhi Guo Chanjuan Fan Zhiyi Wang Xiaokun Xue Pei Liu Linwei
(College of Food Science and Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100)

In the research,pomegranate seed oil(PSO)extracted from the sour pomegranate fruit produced in Lintong,Shanxi Province was used as the protective object.The feasibility on the microencapsulation of highly unsaturated oil that contained with yeast cells was studied.The ratio of the core to wall material,encapsulating temperature and the encapsulating time were optimized by the orthogonal experiment.Light microscope and electro-microscope were utilized for morphology observation.The oxidation stability of the oil was investigated by the accelerate oxidation test at 60℃as well as analysis of the oil component and peroxide value.The optimum encapsulating conditions were 1∶1 of ratio of the core to wall material,encapsulating at 70℃,and lasting the encapsulating procedure for 4 h.On the condition,the oil embedding rate reached to 53.35%.The yeast cells,as microcapsules,were fixed to a better power of fuller cells with smooth and non-greasy surface.The organelle structure became unclear observed by light microscope,TEM and SEM.The fatty acid compositions of the PSO were detected by GC-MS to be with a small difference before and after microencapsulation.The oxidation rate of the oil in the microcapsules was significantly slower than that of the control during the period of the accelerate oxidation test.In conclusion,using yeast cells had efficiently encapsulated pomegranate oil and increases its stability,and the product keeped the cell original shape for very good fluidity and food safety.Therefore,the technology was worthy of further development.

pomegranate seed oil,dried yeast,microencapsule,microstructure,storing stability

TS222+.1

A

1003-0174(2015)02-0043-07

西北农林科技大学大学生创新性试验计划(1210712140)

2013-10-20

刘立志,男,1991年出生,硕士,食品安全与检测

刘邻渭,男,1953年出生,教授,食品化学、分析、营养和安全

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