Logistic回归和ROC曲线分析血清DKK1、GP73和AFP在原发性肝癌诊断中的价值

宗迎迎，徐 浩，许 伟，顾玉明，祖茂衡，万豪光，吴 康

(徐州医学院附属医院介入科，江苏徐州221002)

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈现上升趋势。由于起病隐袭，早期无特异性临床表现和体征，大多数患者在确诊时已属晚期，所以早期发现、早期治疗对提高患者生存率至关重要。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是目前唯一广泛应用于检测PHC的血清标志物，但敏感性(40% ～65%)和特异性(76% ～96%)均不甚令人满意[1]。有研究发现 Dickkopf同源物1(Dickkopf-1，DKK1)、高尔基体糖蛋白73(Golgi protein 73，GP73)[2-3]是值得期待的PHC血清标志物。我们通过检测健康人及不同肝病患者DKK1、GP73和AFP表达水平，建立PHC诊断的统计模型即综合预测模型，应用Logistic回归和受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析DKK1、GP73、AFP及其联合预测因子在PHC诊断中的临床意义。

材料和方法

一、研究对象

2013年8月至2014年7月在徐州医学院附属医院共收集研究对象231例，男189例，女42例，年龄 20～79岁，其中健康对照(healthy control，HC)者50 名、慢性肝炎(chronic hepatitis，CH)患者50例、慢性肝硬化(liver cirrhosis，LC)患者50例、PHC患者81例。各组研究对象在年龄、性别上差异均无统计学意义(P＞0.05)。HC人群来源于徐州医学院附属医院体检正常并排除其他慢性疾病的健康者。肝病诊断标准和肿瘤诊断标准符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎诊断标准及中华人民共和国卫生部2011年制定的《原发性肝癌诊疗规范》中的肝癌诊断标准。

二、试剂和方法

DKK1、GP73测定采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，试剂分别由美国Raybiotech公司和北京热景生物技术有限公司提供，检测均严格按试剂盒说明书操作。血清AFP测定采用电化学发光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)，参考区间为0～20 ng/mL。

三、统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。GP73呈正态分布，用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法或Tamhane's T2法;DKK1、AFP呈非正态分布，用中位数和四分位数[M(P25～P75)]表示，多组之间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较用Mann-Whitney U检验。计数资料的比较应用χ2检验。筛选合适的自变量(纳入标准α ＜0.05，排除标准α ＞0.1)建立肝癌诊断的Logistic回归模型，回归模型的拟合度采用似然比检验，回归参数估计值采用Wald检验。根据ROC曲线及曲线下面积(the area under Roc curve，AUC)评估联合及单项诊断的敏感性和特异性，Z检验比较AUC的差异，检验水准α=0.05。

结 果

一、各组血清DKK1、GP73和AFP检测结果比较

PHC组DKK1、GP73和AFP水平均显著高于CH组、LC组和HC组(P＜0.05)。见表1。

二、血清DKK1、GP73和AFP的ROC曲线分析

采用ROC曲线对 GP73、DKK1和AFP的检测结果进行分析，见图1。ROC曲线确定GP73、DKK1和AFP诊断PHC的临界值分别为192.97、4.48 和 20.00 ng/mL。GP73 的敏感性为 77.8%，特异性为86.7%;DKK1的敏感性为71.6%，特异性为90.0%;AFP的敏感性为58.0%，特异性为78.7%。GP73、DKK1、AFP 联合检测对 PHC 的诊断敏感性为 95.1%，特异性为 72.0%。GP73 诊断PHC 的敏感性明显优于 AFP(χ2=7.25，P ＜0.01)，特异性两者之间差异无统计学意义(χ2=3.35，P=0.07);DKK1 诊断 PHC 的特异性优于AFP(χ2=7.29，P ＜0.01)，敏感性两者之间差异无统计学意义(χ2=3.27，P=0.07)。GP73、DKK1、AFP三者联合诊断PHC的敏感性均优于单独检测(χ2=10.31，P=0.01;χ2=16.04，P ＜ 0.01;χ2=30.94，P ＜0.01)，而特异性明显低于 GP73、DKK1(χ2=9.84，P ＜0.01;χ2=15.79，P ＜0.01)，与 AFP相比差异无统计学意义(χ2=1.79，P=0.18)。

表1 各组血清DKK1、GP73和AFP检测结果的比较 (ng/mL)

图1 GP73、DKK1、AFP和Logistic回归模型检测PHC的ROC曲线

三、PHC诊断模型的构建

以肝病状态(PHC组、非PHC组)为应变量，血清DKK1、GP73、AFP测定结果为自变量，建立Logistic回归模型。本研究模型中各参数的拟合结果见表2。因此得到的模型可表示为 Logit(Ⅱ)= －9.492+0.002×AFP+0.023×GP73+1.058×DKK1。

该模型经过似然比检验，此回归模型具有统计学意义(χ2=160.06，P ＜0.01)。用 ROC 曲线法对上述模型进行诊断价值分析，结果见图1，AUC 为0.93，95%可信区间为 0.89 ～0.97，临界值为0.57，敏感性和特异性分别为 87.7%和90.0%。

表2 AFP、DKK1、GP73联合检测PHC的Logistic模型拟合参数

四、DKK1、GP73、AFP及PHC诊断模型AUC比较

单独用于PHC诊断，DKK1和GP73的AUC均明显大于AFP(P均=0.01)，DKK1与GP73的AUC差异无统计学意义(P=0.79);综合AFP、DKK1、GP73诊断 PHC，Logistic回归模型的AUC分别显著大于 AFP、DKK1和 GP73(P均 ＜0.01)。见表3。

表3 AFP、DKK1、GP73及三者联合诊断PHC的AUC比较

讨 论

PHC是世界第5大常见癌症，其致死率高居世界第3位[4]。而在我国，根据最新公布的2012年《中国肿瘤登记年报》，PHC的发病率居第4位，而病死率高居第2位[5]。PHC起病隐匿，早期多无明显的症状、体征，发现时多数已为中晚期，如不予以积极治疗，自然病程较短，总体5年生存率＜5%[6]。而早期发现、早期诊断、早期治疗可显著提高患者的5年生存率。AFP是目前诊断PHC最重要的肿瘤标志物，已被广泛用于PHC的普查、诊断、判断治疗效果和预测复发，然而其敏感性和特异性均不令人满意，肝硬化结节、脂肪浸润、不典型肝脏炎性病灶及罕见的肝脏良性病变等均可发生AFP升高，且AFP阴性或低滴度阳性肝癌亦无法与肝脏良性病变鉴别[7]。近年来，基因技术、蛋白质组学、肿瘤免疫等方面的研究飞速发展，发现了一系列新的、潜在的肿瘤标志物，其中DKK1、GP73被认为是值得期待的血清标志物。

DKK1是位于人类染色体10q11.2、编码1个长约266氨基酸、相对分子质量为28.7×103的分泌型蛋白，其作为Wnt信号转导通路的拮抗剂，在多种肿瘤发生、发展过程中起着重要作用[8]。本研究发现DKK1在PHC患者中的表达高于HC者及 CH、LC 患者，与陈国栋等[9]及 SHEN 等[10]研究结果一致。最近 CANEPARO等[11]亦发现，DKK1可通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素类蛋白多糖蛋白结合，激活非经典的Wm/平面细胞极性(planar cell polority，PCP)通路，促进了肝癌的发生、发展过程，并且多项研究表明硫酸乙酰肝素类蛋白多糖蛋白在肝细胞癌中表达明显上调[12]。目前有新的研究提出DKK1对PHC诊断的敏感性、特异性均优于AFP[10]。在本研究中，DKK1以4.48 ng/mL为临界值时，其敏感性为71.6%，特异性为90.0%，DKK1诊断PHC的特异性优于AFP(P＜0.01)，而敏感性与AFP相比差异无统计学意义(P=0.07)，考虑是DKK1高表达可能存在多种途径所致，不仅由乙型肝炎病毒感染引起，但因本研究中丙型肝炎病毒和未合并病毒感染的肝癌病例偏少，不能排除检验效能的影响，因此仍需扩大样本量进行验证。

GP73是一种Ⅱ型高尔基体跨膜蛋白，KLADNEY等[13]于2000年首先阐述了其在正常情况下主要由胆管上皮细胞表达，而在肝细胞中表达很少甚至不表达。随后，KLADNEY等[14]发现病毒(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒)感染和非病毒(酒精性及自身免疫性肝病)引起的急、慢性肝病患者血清中GP73表达上调。BLOCK等[15]于2005年首先提出，在肝癌患者血清中GP73水平显著升高。本研究结果显示PHC组GP73含量明显高于CH和LC组，与施前锋等[16]和吴巧萍等[17]的研究结果一致。而陈文莉等[18]的研究结果显示肝癌、LC及肝炎患者间血清GP73水平无差异，还有一些研究认为LC患者血清GP73水平高于 PHC 患者[7，19-20]，与本研究结果相反，这种情况可能是参与这些研究的PHC和LC患者肝损伤的程度不同所致。以GP73＞192.97 ng/mL为临界值时，其敏感性为77.8%，特异性为86.7%，作为诊断PHC的血清指标，GP73的敏感性优于AFP，与国内外文献报道[10，16-17，21]一致。

本研究建立PHC诊断模型，应用Logistic回归模型的似然比检验表明模型的拟合优度较好，采用对模型预报能力判断的ROC曲线对模型进行分析，通过Logistic回归拟合得到联合预测因子，以联合预测因子为诊断指标分析其对PHC的诊断价值。联合预测因子诊断PHC时的AUC高于GP73、DKK1或AFP单项检测，在统计学上联合预测因子的AUC与GP73、DKK1、AFP单项检测相比差异有统计学意义(P＜0.01)。诊断模型AUC 为 0.93(95%可信区间 0.89 ～0.97)，其敏感性和特异性分别为87.8%和90.0%。AUC越大，诊断的价值越大，AUC＞0.9时表示诊断有较高的准确性[22]。

综上所述，DKK1和GP73是新一代肝癌诊断标志物，联合检测为诊断PHC提供了有效途径，可用于PHC高危人群的普查和筛选。ROC曲线分析结合Logistic回归简单、有效，可用于PHC多指标联合诊断的分析评价。本研究也存在一些不足之处:(1)本研究是一个单中心小样本的研究;(2)本研究为非随机对照研究，尽管在研究前对患者的基础资料进行了匹配，但难免会存在一些样本误差。因此，需要更大样本的随机对照研究进一步验证这些肿瘤标志物对PHC的诊断价值。

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