毛乌素沙地典型湖滨湿地土壤石油降解菌分离与鉴定

申卫博，张雪冰，王国栋

(1.西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌 712100;2.中国科学院水利部水土保持研究所/黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室，陕西杨凌 712100;3.西北农林科技大学理学院，陕西杨凌 712100)

石油是人类最主要的能源之一，被称作工业的血液、黑色的金子。随着石油需求量增加，大量的石油及其加工品进入土壤，给人类和环境带来巨大的危害。在石油开采、运输及储存过程中都会造成土壤的污染，油田周围大面积的土壤和水域一般都受到石油污染，造成河流湿地受到严重污染［1］。石油污染土壤不仅影响农作物生长，而且石油烃不易被土壤吸附的成分会渗透到地下水，影响饮用水的水质［2］，进而通过水和土壤转移到生物体，对人类造成危害［3-4］。

对石油污染土壤进行治理，使其在较短时间内恢复到可耕作的标准，对于发展农业生产具有非常重要的意义，特别是微生物降解方法［5］进行生物治理。微生物修复由于具有速度快、消耗少、不造成二次污染、费用低、原位降解污染物等特点，是一种极有前途的技术。因此筛选高效降解石油的微生物菌种，对用于处理石油污染的土壤，将产生很大的社会效益和经济效益［6］。

微生物对石油污染的土壤的降解效果受土壤环境条件的影响［7］。因此要利用微生物修复石油污染的土壤，要先进行油污土壤中石油降解菌的分离与鉴定。本实验选取毛乌素沙地典型湖滨湿地作为研究对象，研究了油污湿地的理化性质，并对存在的石油降解菌进行了分离鉴定，旨在为该地域的微生物修复油污湿地提供理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品的采集 2006—2013年，于毛乌素沙漠地区雨季开始时期在巴吓采当的南岸共选择9个点采集土壤样品。自湖边向湖外围进行取样，分别在距湖边1 m，10 m和50 m处采样。每个采样点取3个重复，采集土样厚度为0～30 cm，分为0～5 cm，5～10 cm 和10～20 cm 三层。将采集的土壤样品封存于无菌塑料袋中，在4℃保存。土壤样品带回实验室后立即进行石油降解菌的分离培养。土壤理化性质的测定采用风干土壤样品进行。

表1 巴吓采当湖滨各采样点的基本情况Tab.1 General situation of sample sites in Baxiacaidang Lake

1.1.2 石油降解菌分离培养基［6］A.石油降解富集培养基:MgS04`7H2O 0.4g，CaCl2·2H2O 0.02 g，K2HP04l g，KH2PO41g，NH4N03l g，酵母膏 l g，蒸馏水l L，微量元素液0.5%，FeCl30.05 g，pH值7.0～7.2，原油5%。

B.牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏2.5 g，蛋白胨 5 g，NaCl 2.5 g，蒸馏水500 mL，pH 值7.2-7.4。

C.血平板:在121℃下将牛肉膏蛋白胨固体培养基灭菌15 min，冷却至50℃后以1∶20加入脱纤维羊血(北京兰伯瑞生物技术有限责任公司)，摇匀后倾注培养基平板上。

D.油平板:将原油溶于25%石油醚中，将石油醚均匀涂布于无机盐固体培养基平板上，每个平板加1.0 mL原油溶液，待石油醚挥发石油凝固后即成油平板。

E.无机盐固体培养基:MgS04`7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.01 g，KH2PO40.5g，K2HP040.5g，NH4N030.5 g，酵母膏 0.5 g，蒸馏水 500mL，微量元素液0.5%，FeCl30.03 g，琼脂9g，pH值7.0～7.2。

1.2 巴吓采当土壤理化性质的测定［8］

土壤有机质含量的测定采用重络酸钾外加热容量法，全氮含量的测定采用半微量凯氏定氮法，速效氮含量的测定采用2mol·L-1KCl侵提——靛酚蓝比色法测定，全磷含量采用HClO4-H2SO4法，速效磷含量的测定采用0.5 mol·L-1NaHCO3侵提——钼锑抗比色法。土壤pH值采用pH计测定(m(土)∶V(水)=1.0∶2.5)。

1.3 石油降解菌的分离与鉴定

1.3.1 分离［6］9个采样点各秤取5g土样，利用石油降解菌富集培养基，富集培养7d。培养条件为30℃下180r/min。取富集液10mL接到富集培养基中再发酵7 d。如此循环培养4次后，将富集液稀释为 10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和 10-8共 8 个稀释度，取 10-6，10-7，10-83个稀释度各0.1mL涂布于血平板上，放置在37℃恒温箱中培养24～48h观察。利用牛肉膏蛋白胨液体培养基富集培养血平板上溶血圈较明显的菌落2d，培养条件为30℃下180r/min。按上述方法进行梯度稀释，取10-6，10-7，10-83个稀释度各0.1mL涂布于油平板，37℃恒温培养2 d。利用牛肉膏蛋白胨平板分离油平板上噬油斑较明显的菌株，分离成单菌落。

1.3.2 鉴定［9］菌体DNA的分离纯化使用试剂盒，提取石油降解菌的基因组总DNA。

PCR反应的产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。16S rDNA由上海生物工程技术有限公司测序完成。

序列同源性分析:序列信息输入NCBI数据库进行BLASTN比对分析。

1.4 数据处理

利用SPSS软件和SigmaPlot软件对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 巴吓采当湖滨土壤基本理化性质分析

对巴吓采当9个采样点土壤的基本理化性质进行测定，结果见表2。由表2可见，巴吓采当地区土壤pH值大都在7.0以下，为偏酸性土壤。由表2可看出，芦苇地、草木樨地和沙柳地的有机质含量随土壤深度增加呈降低趋势，有机质含量为3.47～72.36g/kg，西北地区土壤有机质含量一般在 6.0 ～10.0g/kg［10］，说明巴吓采当地区有机质含量整体较高，这与湿地富营养化及周围农田化肥污染相关。在0～5 cm层土壤有机质含量为草木樨＞芦苇＞沙柳，在5～10 cm层土壤有机质含量为芦苇＞草木樨＞沙柳，10～20 cm层土壤有机质含量为草木樨＞芦苇＞沙柳。芦苇地和草木樨土壤有机质含量较高，可能是因含有大量腐殖质。巴吓采当土壤硝态氮含量为2.57～14.19mg/kg，铵态氮含量为16.53～37.45mg/kg，土壤硝态氮和铵态氮含量随土壤深度增加呈先降低后升高的趋势。全磷含量为0.28～1.04g/kg，土壤全磷含量与有机质变化趋势基本一致，利用SPSS做相关分析，相关系数 R=0.9750(p=0.01)，呈显著正相关。速效磷含量为3.93～10.26mg/kg，比张姗姗［11］研究红碱淖速效磷含量高，可能与巴吓采当周围农田使用磷肥有关。综上分析可知，巴吓采当湖滨土壤为酸性土壤，土壤养分比红碱淖湖滨土壤高。

2.2 巴吓采当湖滨土壤石油降解菌的筛选和鉴定

16S rDNA序列的测定结果用BLAST软件与GenBank中已发表的16S rDNA序列进行同源性比较，结果表明，3-12与5-3都与炭疽杆菌(Bacillus anthraci)和枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)亲缘关系较近，同源性均达到99%。经序列比对和系统发育学分析确定，可以将3-12鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，5-3为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)。3-12和5-3系统发育树如图1。

表2 巴吓采当湖滨土壤的基本理化性质Tab.2 Soil physic-chemical properties in Baxiacaidang Lakeside

图1 石油降解菌系统发育树Fig.1 16S rDNA sequence homology analysis of oil degradation bacteria degradation strain

3 结论

1)巴吓采当地区土壤为酸性土壤。土壤有机质、全磷、速效磷等含量较高，这可能与水体富营养化及周边农田化肥污染有关。

2)巴吓采当土壤与红碱淖土壤相比，土壤酸碱性不同。巴吓采当为酸性土壤，红碱淖为碱性或强碱性土壤。巴吓采当土壤的有机质、全磷等含量高于红碱淖。

3)巴吓采当土壤经分离筛选后得出两种石油降解菌，即蜡样芽胞杆菌和苏云金芽孢杆菌。

本次实验对毛乌素沙地典型湖滨湿地——巴吓采当土壤的理化性质、石油降解菌资源做了初步调查，结果为该地区有机质、全磷等含量比红碱淖较高，为解决湿地石油污染，改良土壤奠定基础。在后续的实验中，笔者将采用室内培养模拟实验的方法，针对土壤、环境等因子对石油降解菌降解石油效果的影响机理及适合沙地石油降解菌最优配比做出进一步研究。

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