免疫性血小板减少症患者协同刺激分子的表达及意义

任敏+单哲+许联红

【摘要】 目的：探讨特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者外周血淋巴细胞CD28、CD80及CD86的表达及意义。方法：采用免疫荧光标记和流式细胞术检测30例ITP患者和30例健康对照者外周血CD28细胞、CD80细胞和CD86细胞分别占淋巴细胞的比例及血小板表面相关抗体水平，并进行对比、分析。结果：与正常对照组相比，ITP患者外周血CD28细胞增多，差异有统计学意义（P<0.05）；CD80细胞增多，但差异无统计学意义（P>0.05）；CD86细胞显著增多，差异有统计学意义（P<0.05），此结果与ITP是否急慢性无关。治疗前后患者的CD28、CD80及CD86的表达率比较差异无统计学意义（P>0.05）。患者与正常对照组PAIgA、PAIgG和PAIgM的水平比较差异有统计学意义（P<0.05）；CD80、CD86表达与PAIgG水平之间存在显著的相关性，比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论：ITP患者外周血淋巴细胞CD28、CD80及CD86表达均异常，可能与其发病相关。

【关键词】 免疫性血小板减少症； CD28； CD80； CD86

免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia，ITP）是一类以血小板数量减少为主要特点的出血性疾病，其表现为血小板寿命缩短，骨髓象见骨髓巨核细胞数目增多，一般脾脏无明显肿大[1]。目前的研究表明，该类疾病患者存在免疫反应异常，导致其体内产生血小板抗体（PAIg），引起血小板被巨噬细胞破坏增加。而有研究显示，T、B淋巴细胞的免疫异常与ITP的发病密切相关，包括其活化、增殖、凋亡异常等方面，而在这一过程中协同刺激分子（CD28、CD80、CD86）的作用显得尤为重要[2-3]。为了探讨ITP发病的免疫相关机制，笔者采用免疫荧光标记及流式细胞技术检测ITP患者外周血淋巴细胞中CD28、CD80、CD86的表达，并检测ITP患者血小板抗体（PAIgA、PAIgG和PAIgM）水平，分析其与协同刺激分子表达改变的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月-2014年6月间本院门诊及住院的ITP患者30例，诊断均符合第3版《血液病诊断及疗效标准》[1]。选择30例近期无感染、肝炎、结核的健康志愿者作为正常对照组，ITP组年龄18～75岁，中位年龄46岁，其中男16例，女14例，急性18例，慢性18例，采集标本时血小板数为（2～45）×109/L，未行脾切除治疗。正常对照组年龄18～70岁，中位年龄42岁，其中男15例，女15例，采集标本时血小板为正常，所有研究对象采血时均未接受血小板输注。

1.2 材料及试剂 FACSCalibur型流式细胞仪为BD公司产品。单克隆抗体CD4-APC，CD28-PE，CD80-FITC，CD86-PE，CD19-APC及其阴性对照均购于美国BD Pharmingen公司。

1.3 方法

1.3.1 CD28、CD80、CD86的检测 （1）标本采集：采集受检者空腹静脉血2 mL， EDTA-K2抗凝。（2）单克隆抗体标记：分别取100 μL抗凝血放入3支验管和1支对照管，实验管分别加20 mL CD28-PE、CD80-PE、CD86-PE，对照管加20 mL鼠抗人IgG1-PE，室温避光孵育30 min，加入细胞裂解液2 mL混匀，静置8 min，300 g离心5 min。（3）弃上清，加入PBS缓冲液，混匀200 g离心5 min。（4）弃上清，每管加入250 mL鞘液，重悬细胞，上流式细胞仪检测。（5）协同刺激分子的检测：用前向角散射和侧向角散射散点图区分细胞群体，用门圈出分析的淋巴细胞群体。每份标本检测20 000个细胞。计算CD28、CD80及CD86阳性细胞比例。

1.3.2 血小板相关抗体（PAIg）检测 采用酶联免疫法测定PAIg，抽取受检者静脉血4 mL，EADT-Na2抗凝，分离血小板，按ELISA法试剂盒操作说明书进行PAIg检测。

1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

3 讨论

有研究显示，在ITP患者体内可检测到血小板的自身抗体，这些抗体能够与血小板的表面抗原结合，与巨噬细胞Fc受体相互作用，进而导致巨噬细胞对血小板的清除，引起血小板的减少[4]。目前已有试验证实，T淋巴细胞在ITP患者体内的异常活化，导致了自身抗血小板抗体的产生，从而引起ITP发病[5]。

在T细胞的活化过程中，需要两个信号进行刺激，一个是来自抗原递呈细胞（APC）表面的MHC-Ag复合体，其通过T细胞上的TCR/CD3传递给T细胞的初始激活信号。另一个则是协同刺激信号，该类协同刺激因子是由APC和T细胞表面的黏附分子相互作用所提供的。目前研究所发现的最重要的协同刺激因子是CD80、CD86与CD28，CD80、CD86作为受体，广泛存在于抗原递呈细胞（APC）上，如B淋巴细胞、单核巨噬细胞，而CD28则是T淋巴细胞上的相应配体[6]。CD28属于免疫球蛋白超家族成员，其定位于染色体2q33区[7-8]。它主要表达于T细胞和浆细胞表面。通过CD28/B7分子对T细胞的协同刺激作用可增强IL-2基因转录，促进IL-2合成[9]。另外，CD28分子所启动的胞内信号还可促进Bcl-XL表达从而保护T细胞免于凋亡[10]。赵艳霞等[11]发现，ITP患者外周血CD4+CD28+细胞表达下调，从而使T细胞易被诱导凋亡因素激活而凋亡。

根据McMillan R等[12]的研究报道，ITP发病时B细胞能够产生抗血小板自身抗体，该抗体的产生受Th细胞及他们产生的细胞因子所控制，因此，在ITP的发病过程中存在Th1/Th2的平衡紊乱以及细胞因子的异常分泌，从而使B细胞出现活化异常进而产生抗血小板抗体，最终导致ITP的发病。有文献[13]报道ITP患者存在T细胞亚群Th1/Th2失衡，而B细胞表面的CD80、CD86表达率明显上升，从而提示两者在ITP发病机制中起一定作用。endprint

笔者的研究结果显示，ITP患者的外周血淋巴细胞CD28表达率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），提示ITP患者T细胞活化存在异常，但这与潘建玲等[14]的报道并不一致。与正常对照组相比，ITP患者的外周血淋巴细胞CD80的表达率均偏高，但差异无统计学意义（P>0.05），究其原因，可能与试验例数偏少有关，CD86的表达率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），这与相关文献[15]报道也是相一致的，这表明CD28：CD80和CD28：CD86协同刺激通路可能参与ITP的发病。通过对CD80、CD86表达率与PAIgG的相关性分析证明了由于ITP患者的B细胞活化异常，导致过多的血小板自身抗体产生，其可游离于血液中，也能够与血小板结合，因此与血小板结合的PAIg的检测阳性率较高。此外，笔者还将治疗前后ITP患者的协同刺激分子表达率加以比较，虽然经过糖皮质激素或丙种球蛋白治疗，患者的血小板数量可以上升至正常，但治疗前后的CD28、CD80及CD86的表达率差异无统计学意义（P>0.05），且通过随访笔者发现很多患者会出现病情反复，这是否提示目前的治疗方法，如糖皮质激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗体，不能从本质上阻断血小板抗体的产生；是否会有相应的单克隆抗体药物产生，能够通过CD28、CD80与CD86的协同刺激途径，抑制B淋巴细胞的活化，减少血小板自身抗体的产生，达到治疗ITP的作用，这也已然成为ITP治疗研究的新方向。

参考文献

[1]张之南.血液病诊断及诊疗标准[M].第2版.北京：科学出版社，1998：2-5.

[2]常涛涛，郝国平.原发性ITP患儿外周血血小板相关抗体和淋巴细胞亚群的变化及临床意义[J].中国医学创新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣辉，毕来喜，韩义香，等.CD28/CTLA-4：B7在特发性血小板减少性紫癜患者外周血淋巴细胞中的表达和意义[J].临床血液学杂志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]马肖容，陈银霞，张王刚，等.特发性血小板减少性紫癜患者外周血共刺激分子的表达与血小板抗体关系的临床研究[J].中国实验血液学杂志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]马进才.急性冠脉综合征双重抗血小板联用质子泵抑制剂150例临床观察[J].中国医学创新，2013，10（14）：32-33.

[11]杨继红.小红细胞对血细胞分析仪血小板计数的影响[J].中国医学创新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷树勇，陆爱权，陈海云，等.急性ITP患儿外周血CD4+CD25+ Tr细胞及其与IL-18的相关性研究[J].中国医学创新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，关秀茹，马学华，等.特发性血小板减少性紫癜患者协同刺激分子的表达[J].中国免疫学杂志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁红，高娟，等.单采血小板采集提速后对血小板质量和献血反应率的影响[J].中国医学创新，2012，9（32）：144-146.

（收稿日期：2014-07-09） （本文编辑：陈丹云）endprint

笔者的研究结果显示，ITP患者的外周血淋巴细胞CD28表达率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），提示ITP患者T细胞活化存在异常，但这与潘建玲等[14]的报道并不一致。与正常对照组相比，ITP患者的外周血淋巴细胞CD80的表达率均偏高，但差异无统计学意义（P>0.05），究其原因，可能与试验例数偏少有关，CD86的表达率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），这与相关文献[15]报道也是相一致的，这表明CD28：CD80和CD28：CD86协同刺激通路可能参与ITP的发病。通过对CD80、CD86表达率与PAIgG的相关性分析证明了由于ITP患者的B细胞活化异常，导致过多的血小板自身抗体产生，其可游离于血液中，也能够与血小板结合，因此与血小板结合的PAIg的检测阳性率较高。此外，笔者还将治疗前后ITP患者的协同刺激分子表达率加以比较，虽然经过糖皮质激素或丙种球蛋白治疗，患者的血小板数量可以上升至正常，但治疗前后的CD28、CD80及CD86的表达率差异无统计学意义（P>0.05），且通过随访笔者发现很多患者会出现病情反复，这是否提示目前的治疗方法，如糖皮质激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗体，不能从本质上阻断血小板抗体的产生；是否会有相应的单克隆抗体药物产生，能够通过CD28、CD80与CD86的协同刺激途径，抑制B淋巴细胞的活化，减少血小板自身抗体的产生，达到治疗ITP的作用，这也已然成为ITP治疗研究的新方向。

参考文献

[1]张之南.血液病诊断及诊疗标准[M].第2版.北京：科学出版社，1998：2-5.

[2]常涛涛，郝国平.原发性ITP患儿外周血血小板相关抗体和淋巴细胞亚群的变化及临床意义[J].中国医学创新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣辉，毕来喜，韩义香，等.CD28/CTLA-4：B7在特发性血小板减少性紫癜患者外周血淋巴细胞中的表达和意义[J].临床血液学杂志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]马肖容，陈银霞，张王刚，等.特发性血小板减少性紫癜患者外周血共刺激分子的表达与血小板抗体关系的临床研究[J].中国实验血液学杂志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]马进才.急性冠脉综合征双重抗血小板联用质子泵抑制剂150例临床观察[J].中国医学创新，2013，10（14）：32-33.

[11]杨继红.小红细胞对血细胞分析仪血小板计数的影响[J].中国医学创新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷树勇，陆爱权，陈海云，等.急性ITP患儿外周血CD4+CD25+ Tr细胞及其与IL-18的相关性研究[J].中国医学创新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，关秀茹，马学华，等.特发性血小板减少性紫癜患者协同刺激分子的表达[J].中国免疫学杂志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁红，高娟，等.单采血小板采集提速后对血小板质量和献血反应率的影响[J].中国医学创新，2012，9（32）：144-146.

（收稿日期：2014-07-09） （本文编辑：陈丹云）endprint

笔者的研究结果显示，ITP患者的外周血淋巴细胞CD28表达率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），提示ITP患者T细胞活化存在异常，但这与潘建玲等[14]的报道并不一致。与正常对照组相比，ITP患者的外周血淋巴细胞CD80的表达率均偏高，但差异无统计学意义（P>0.05），究其原因，可能与试验例数偏少有关，CD86的表达率明显高于正常对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），这与相关文献[15]报道也是相一致的，这表明CD28：CD80和CD28：CD86协同刺激通路可能参与ITP的发病。通过对CD80、CD86表达率与PAIgG的相关性分析证明了由于ITP患者的B细胞活化异常，导致过多的血小板自身抗体产生，其可游离于血液中，也能够与血小板结合，因此与血小板结合的PAIg的检测阳性率较高。此外，笔者还将治疗前后ITP患者的协同刺激分子表达率加以比较，虽然经过糖皮质激素或丙种球蛋白治疗，患者的血小板数量可以上升至正常，但治疗前后的CD28、CD80及CD86的表达率差异无统计学意义（P>0.05），且通过随访笔者发现很多患者会出现病情反复，这是否提示目前的治疗方法，如糖皮质激素、免疫球蛋白清除部分血小板抗体，不能从本质上阻断血小板抗体的产生；是否会有相应的单克隆抗体药物产生，能够通过CD28、CD80与CD86的协同刺激途径，抑制B淋巴细胞的活化，减少血小板自身抗体的产生，达到治疗ITP的作用，这也已然成为ITP治疗研究的新方向。

参考文献

[1]张之南.血液病诊断及诊疗标准[M].第2版.北京：科学出版社，1998：2-5.

[2]常涛涛，郝国平.原发性ITP患儿外周血血小板相关抗体和淋巴细胞亚群的变化及临床意义[J].中国医学创新，2013，10（9）：1-2.

[3]章圣辉，毕来喜，韩义香，等.CD28/CTLA-4：B7在特发性血小板减少性紫癜患者外周血淋巴细胞中的表达和意义[J].临床血液学杂志，2010，23（2）：77-79.

[4] McMillan R.The pathogenesis of chronic immune （idiopathic） thrombocytopenic purpura[J].Seminars in hematology，2000，37（1）：5-9.

[5] Beardsley D S.Pathophysiology of immune thrombocytopenic purpura[J].Blood Rev，2002，16（1）：13-14.

[6]马肖容，陈银霞，张王刚，等.特发性血小板减少性紫癜患者外周血共刺激分子的表达与血小板抗体关系的临床研究[J].中国实验血液学杂志，2009，17（2）：483-486.

[7] Janeway C A Jr，Bottomly K.Signals and signs for lymphocyte responses[J].Cell，1994，76（2）：275-285.

[8] June C H，Bluestone J A.The B7 and CD28 receptor families[J].ImmunolToday，1994，15（7）：321-331.

[9] Sanchez Lockhart M，Mill E R J.Engagement of CD28 outside of the immunological synapse result sinup-egulation of IL22 mRNA stability but not IL-transcription[J].Immunol，2006，176（8）：4778-4784.

[10]马进才.急性冠脉综合征双重抗血小板联用质子泵抑制剂150例临床观察[J].中国医学创新，2013，10（14）：32-33.

[11]杨继红.小红细胞对血细胞分析仪血小板计数的影响[J].中国医学创新，2012，9（28）：70-71.

[12]McMillan R.Autoantibodies and autoantigens in chronic immune Thrombocytopenicurpura[J].Sem in Hematol，2000，37（3）：239-248.

[13]雷树勇，陆爱权，陈海云，等.急性ITP患儿外周血CD4+CD25+ Tr细胞及其与IL-18的相关性研究[J].中国医学创新，2013，10（1）：41-43.

[14]潘建玲，关秀茹，马学华，等.特发性血小板减少性紫癜患者协同刺激分子的表达[J].中国免疫学杂志，2007，8（20）：16-19.

[15]滕平，袁红，高娟，等.单采血小板采集提速后对血小板质量和献血反应率的影响[J].中国医学创新，2012，9（32）：144-146.

（收稿日期：2014-07-09） （本文编辑：陈丹云）endprint