紫杉醇对人肝癌细胞SMMC-7721 黏附及侵袭转移潜能的影响

徐律韵（东南大学医学院附属南京同仁医院急诊科，江苏南京211102）

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率高，总体预后差。究其原因，主要是由于肝癌具有极高的转移复发率。从一定程度上讲，抑制肿瘤细胞的黏附和侵袭可以控制或降低肿瘤转移的发生[1]。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一种非受体型酪氨酸激酶，在包括肝癌在内的多种肿瘤中表达，对肿瘤的黏附、迁移、侵袭等行为起着重要的调控作用[2-3]。紫杉醇（paclitaxel）是从红豆杉属植物紫杉的树皮和树干中提取并开发利用的天然抗癌药物，既往研究发现，紫杉醇通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用[4-5]，但其他抗肿瘤机制有待进一步阐明。本研究选用人肝癌细胞株SMMC-7721 作为研究对象，观察紫杉醇对该细胞的黏附及侵袭转移潜能的影响，进一步阐明紫杉醇新的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 紫杉醇，购自上海华联制药有限公司，使用时用0.9%氯化钠溶液稀释至所需浓度。人肝癌细胞株SMMC-7721、鼠成纤维细胞株NIH3T3 购自中国医学科学院上海细胞库。RPMI 1640 培养基（美国Gibco 公司），小牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司），鼠抗人FAK 抗体、羊抗鼠多克隆二抗（美国Santa Cruz 公司），Transwell 小室（美国Corning 公司），Matrigel 胶、电泳仪（美国BD 公司），酶标仪（美国BIO-RAD 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 SMMC-7721 及NIH3T3 细胞均培养于含10%小牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素150 μg/mL 的RPMI 1640 培养基中，37 ℃、5%CO2培养箱内培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 体外细胞-基质黏附实验 每孔30 μL Matrigel 胶包被96孔板，成胶后加入浓度为5×105mL-1的SMMC-7721 细胞悬液100 μL。待细胞贴壁后加入不同浓度的紫杉醇，终浓度分别为10、20、40 nmol/L（紫杉醇组），对照组加入培养液。培养箱内孵育1 h后，弃去培养液，每孔加入200 μL 无血清培养液和5 mg/mL 的MTT 20 μL，继续培养4 h 后弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡后在酶标仪波长570 nm 处读取各孔吸光度（OD）值，以OD值代表黏附细胞数。按下列公式计算细胞黏附抑制率：抑制率（%）=[1－（加药孔平均OD 值－空白孔平均OD 值）/（对照孔平均OD值－空白孔平均OD 值）]×100%。实验重复3 次。

1.2.3 体外细胞侵袭实验 参照文献[6]将Transwell 小室4 ℃预冷，Matrigel 胶冰上融化后每室200 μL 加至Transwell 上室。成胶后分别消化经过不同浓度紫杉醇（10、20、40 nmol/L）干预24 h 后的SMMC-7221 细胞，用培养液调整细胞浓度为每毫升5×104个，取800 μL 细胞悬液加于成胶后的Transwell 上室。在Transwell 下室内加入经饥饿培养24 h 的NIH3T3 细胞培养上清液1.2 mL 作为趋化因子，培养箱中孵育24 h。弃去上室中的培养液，用0.9%氯化钠溶液棉签轻擦去Matrigel 胶，在倒置显微镜下观察侵袭细胞数量，然后将膜取出，95%乙醇固定10 min，苏木精-伊红（HE）染色。光镜（×200）下任取5 个不重复视野，计数每个视野穿透Matrigel 胶的肝癌细胞数。实验重复3 次，取平均值。

1.2.4 体外细胞迁移实验 方法步骤与1.2.3 中体外侵袭力测定相同，只是侵袭小室的滤膜不用Matrigel 胶覆盖。

1.2.5 蛋白免疫印迹（Western blot）检测FAK 蛋白表达 不同浓度紫杉醇（10、20、40 nmol/L）干预SMMC-7721 细胞24 h 后，收集细胞蛋白样品。取20 μg 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），随后以半干电转移恒流转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，脱脂牛奶封闭后，加入1∶500 稀释的鼠抗人FAK 一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入1∶1 000 稀释的羊抗小鼠-辣根过氧化物酶（HRP）室温下孵育2 h，反复洗膜后加入化学发光（ECL）显色液，保鲜膜封膜，暗室压片曝光，经显影、定影后，惠普扫描仪扫描胶片，存为图片。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，用上海复日公司Smart view 图像分析处理系统对Western blot 曝光胶片进行灰度扫描，以灰度的高低代表蛋白表达高低。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0 统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 紫杉醇对SMMC-7721 细胞与Matrigel 胶黏附的影响 紫杉醇具有抗SMMC-7721 细胞与Matrigel 胶黏附的作用，其作用强度随着药物浓度的升高而上升，10、20、30 nmol/L 紫杉醇的黏附抑制率分别为：（24.96±6.65）%、（44.85±4.53）%、（63.86±7.72）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），且各紫杉醇作用浓度之间的黏附抑制率比较，差异也有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 不同浓度紫杉醇细胞基质黏附实验结果

2.2 紫杉醇对SMMC-7721 细胞侵袭和迁移能力的影响 不同浓度紫杉醇干预SMMC-7721 细胞24 h 后，穿过滤膜的细胞数分别较对照组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05 或0.01），提示SMMC-7721 的侵袭及迁移能力均明显下降，见表1、图2。

表1 紫杉醇对SMMC-7721 侵袭和迁移能力的影响（±s，%）

表1 紫杉醇对SMMC-7721 侵袭和迁移能力的影响（±s，%）

注：与对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01。

组别对照组紫杉醇组10 nmol/L 20 nmol/L 40 nmol/L侵袭能力 迁移能力80.67±5.76 110.33±9.87 55.33±4.56a 35.67±4.16b 14.00±2.08b 90.67±7.02a 50.67±7.23b 20.67±3.12b

图2 侵袭及迁移实验结果

2.3 紫杉醇对SMMC-7721 细胞FAK 蛋白表达的影响 不同浓度紫杉醇作用于SMMC-7721 细胞24 h 后，各实验组FAK 蛋白表达水平逐渐下降。将对照组FAK 的表达率定为100%，10、20、30 nmol/L 的紫杉醇分别作用后，SMMC-7721 细胞内FAK 蛋白的表达率分别为（76.90±6.04）%、（42.92±3.75）%、（16.67±3.77）%，与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），且各紫杉醇作用浓度间的FAK 表达差异也有统计学意义（P＜0.01），见图3；其典型Westen blot 凝胶电脉图见图4。

图3 不同浓度紫杉醇下调SMMC-7721 细胞内FAK 蛋白的表达

图4 Westen blot 条带图

3 讨 论

肿瘤细胞的侵袭与转移是恶性肿瘤的基本特征之一，如何阻断癌细胞的侵袭与转移，延长带瘤生存时间，是目前肿瘤治疗研究的热点之一[7]。FAK 在包括肝癌在内的多种肿瘤中均高表达[8]。Itoh 等[9]发现，肝癌组织中高表达的FAK 与肝癌细胞的黏附、播散、凋亡、迁移、侵袭能力呈正相关；同时，FAK 是整合素依赖性信号传导通路中的基础分子，其作为胞内信号转导的平台，介导细胞内外信号网络系统的交联反应， 活化多条信号传导通路， 进而调节肿瘤细胞的恶性表型和侵袭转移等行为[10]。

紫杉醇类药物能促进微管蛋白装配成微管，抑制微管的解聚，从而导致微管束排列异常，形成星状体后使纺锤体失去正常功能，抑制细胞有丝分裂，导致细胞死亡，从而抑制肿瘤细胞增殖。目前已有较多研究表明，紫杉醇抗肿瘤毒性除与抗微管作用有关外，还与诱发细胞凋亡有关[11]。以往关于紫杉醇的研究大多集中在其促肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤生长的作用方面，较少涉及在肿瘤侵袭转移中的作用研究。肿瘤细胞侵袭或转移过程中的关键步骤是穿过基底膜，其过程包括：（1）通过细胞的表面受体黏附到基底膜上；（2）分泌多种酶降解邻近的基底膜组织；（3）在化学趋化物的作用下穿透移动到目标组织。本研究观察了紫杉醇作用于人肝癌细胞SMMC-7721 后对其侵袭转移潜能的影响，并初步探讨其可能机制，利用体外黏附和侵袭、迁移实验证实紫杉醇有抗SMMC-7721 细胞黏附、侵袭、转移的作用，同时，用western blot方法进一步研究其机制发现，不同浓度紫杉醇干预SMMC-7721细胞24 h 后，各组细胞内FAK 的蛋白表达量均随药物浓度的增加而减少，呈剂量依赖性，提示紫杉醇可能通过FAK信号通路抑制肝癌细胞的黏附、侵袭及转移，而有关紫杉醇下调FAK 表达后，FAK通过何种信号通路来影响肿瘤细胞的转移，还有待进一步研究。

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