RGS17 在不同肝癌细胞株及HuH7 裸鼠移植瘤中的表达

曹 静，王云杰，李俊生（. 临沂市人民医院药学部，山东 临沂76003；. 临沂经济技术开发区人民医院，山东 临沂7603）

异源三聚体鸟苷酸调节蛋白（G 蛋白）信号通路在正常肝组织生长和再生中起着重要作用[1]，而在肝癌组织中G 蛋白的表达和功能均失常[2]。鉴于G 蛋白的表达和功能对正常肝细胞及肝癌细胞均有十分重要的作用，作者设想G 蛋白信号转导调节因子（regulator of G protein signalling，RGS）在调节肝细胞癌形成的过程中可能也起着同样重要的作用。2013 年1～10 月，作者从体外细胞株和裸鼠体内2 个层面观察了RGS17 在正常肝细胞和肝癌细胞株的表达，探讨其在肝细胞癌发生和发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及动物 肝癌细胞株HepG2、HuH7 及正常肝细胞株THLE-2（上海交通大学上海市肿瘤研究所惠赠）；无特定病原体（SPF）4 周龄雄性裸鼠10 只[购于上海斯莱克动物中心，批号SCXK（沪）2012-0002]。

1.1.2 主要试剂与仪器

1.1.2.1 主要试剂 细胞培养用胎牛血清（美国Gibco 公司原装进口）和DMEM 培养基（杜氏改良培养基，美国Gibco 公司产品）；实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）两步法试剂盒及逆转录酶（日本Takara 公司产品）；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司产品）；引物（上海生工有限公司合成）；焦磷酸二乙酯（DEPC）水（购自杭州碧云天公司）；氯仿（购自Sigma 公司）；异丙醇（购自德国Merck 公司）；抽提RNA 用无RNA 酶EP 管和real-time-PCR 管（购自美国Axygen 公司）；CCK-8 试剂（日本同仁公司生产，原装进口）。

1.1.2.2 主要仪器 细胞培养皿和96 孔培养板（美国Corning 公司）；5%CO2细胞培养箱和处理细胞用超净工作台（EQR/GL-65，美国Thermo 公司生产）；逆转录聚合酶链反应仪（美国Bio-Rad 公司生产）；real-time-PCR 仪（美国ABI 公司生产）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肝癌细胞株HepG2、HuH7 及正常肝细胞株THLE-2 用DMEM 细胞培养液及10%胎牛血清培养，培养液中加入青霉素（100 μg/mL）和链霉素（50 μg/mL）以防止细胞污染。细胞在37 ℃、5%CO2无菌细胞培养箱中培养（时间不固定，根据细胞生长情况，至少2 d 以上）。细胞换液、传代、冻存等操作均在无菌细胞超净工作台进行。细胞贴壁生长至80%覆盖时传代，先用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，再用2.5%胰酶0.5 mL 消化，镜下见细胞变圆时弃去胰酶溶液，用含10%胎牛血清培养基吹打，将1 个细胞培养皿的细胞传入3 个细胞培养皿备用。

1.2.2 细胞增殖活力检测 将细胞消化计数，铺入96 孔细胞培养板，每孔约2 000 个细胞。从铺板第2 天起检测细胞活性，每天1次。检测时将孔中培养基吸净，加入用培养基配成的10%CCK-8检测试剂，37 ℃放置1.5 h，用酶标仪在450 nm 波长检测其光密度（OD）值，间接反映细胞活性。

1.2.3 动物皮下移植成瘤模型的建立 取SPF 4 周龄雄性裸鼠10 只，采用自身对照试验，在裸鼠皮下接种肝癌细胞株HuH7，成瘤后检测瘤组织（模型组）和肝组织（对照组）中RGS17 mRNA 的表达差异。具体方法如下。

1.2.3.1 模型组 扩增培养HuH7 细胞，从6 cm 培养皿传入10 cm培养皿，使细胞数达到2×107个；消化细胞，显微镜下计数，用不加胎牛血清的DMEM 培养液稀释细胞至1×104μL-1，置于冰上；用1 mL 注射器将培养的细胞悬液200 μL 皮下注射于裸鼠左侧腹股沟处，每3 天观察成瘤情况；成瘤后28 d 取瘤时，将裸鼠用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，用组织剪剪开裸鼠皮肤，用镊子及眼科剪协助将肿瘤组织从皮下完整剥离切除，称质量后放入PBS中等待裂解提取总RNA。

1.2.3.2 对照组 将裸鼠用戊巴比妥钠麻醉，组织剪小心剪开其皮肤，用镊子夹起胸骨，剪开腹部肌肉暴露腹腔，将肝脏完全切除，放入PBS 中等待裂解提取RNA。

1.2.4 总RNA 提取及逆转录 将1.2.1 中培养的3 种细胞和1.2.3 中移植的瘤块组织（每块1 g）用PBS 冲洗，对瘤块组织和肝组织抽提的RNA，应先用匀浆器匀浆，加入1 mL Trizol 试剂，反复吹打消化后，加入200 μL 氯仿，振荡混匀15 s，室温静置3 min，然后4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。微量移液器吸取上清液放入新的无RNA 酶的1.5 mL EP 管中。每管加500 μL 预先冰上冷冻的异丙醇，-20 ℃沉淀0.5 h，然后4 ℃、12 000 r/min 离心15 min。离心后可见管底有白色RNA 沉淀，用DEPC 水配制的75%无水乙醇洗一遍后晾干，用50 μL DEPC 水溶解RNA 备用。取1 μL 作为逆转录模板，80 ℃5 s、37 ℃15 min 进行逆转录。

1.2.5 real-time-PCR 引物序列 将逆转录获得cDNA 稀释10 倍，取4 μL 为模板配制50 μL 反应液。RGS 上游引物序列：5′-CAGAG GCCCAACAACACCTG-3′；下游引物序列：5′-TGTGGGTCTTCCCGCATTTT-3′。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）上游引物序列：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′；下 游 引 物 序 列：5′-ACACCAT GTATTCCGGGTCAAT-3′。反应条件：95 ℃变性30 s、95 ℃退火5 s、60 ℃延伸31 s，40 个循环。扩增产物分别为105、116 bp，得到Ct值后用2-△△Ct方法计算结果。

1.3 统计学处理 应用SSPS11.0 统计软件进行数据分析，组间比较采用t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞活力检测 细胞培养中，用CCK-8 检测细胞活力，连续检测4 d，可见肝癌细胞株HepG2、HuH7 及正常肝细胞株THLE-2的细胞增殖呈稳定上升趋势（图1），表明细胞生长状态良好，可以进行细胞水平mRNA 检测及裸鼠成瘤实验。

图1 肝癌细胞株HepG2、HuH7 及正常肝细胞株THLE-2 增殖曲线

2.2 HepG2、HuH7 及THLE-2 中RGS mRNA 的表达 3 种细胞抽提总RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性见图2。由图2 可见，所抽提总RNA 28 s 条带明亮，提示RNA 完整性好，未见降解，满足下一步逆转录反应及real-time PCR 的需要。real-time PCR结果显示，设THLE-2 细胞RGS17 mRNA 表达水平为1，HepG2、HuH7 细 胞RGS17 mRNA 表 达 水 平 分 别 为3.20±0.92、11.60±2.53，提示肝癌细胞HepG2、HuH7 表达水平明显高于正常肝细胞株THLE-2，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图2 3 种细胞抽提RGS17总RNA 琼脂糖凝胶电泳图

图3 RGS17 mRNA 在3 种细胞株中的表达

2.3 裸鼠成瘤模型的建立 模型组裸鼠在注射HuH7 细胞后12 d，在裸鼠左侧腹股沟处可见皮下瘤块形成，待其继续生长14 d后，用游标卡尺检测肿瘤瘤块大小，其体积如表1 所示。说明在裸鼠皮下移植肝癌细胞成瘤造模成功。

2.4 裸鼠瘤块组织及正常肝组织中RGS17 mRNA 的表达 用real-time PCR 方法检测裸鼠瘤块组织及肝组织中RGS17 mRNA的表达，发现模型组有8 只裸鼠瘤块组织中RGS17 mRNA 高表达，2 只裸鼠瘤块组织中RGS17 mRNA 低表达，见图4、5。

表1 模型组裸鼠瘤块生长情况（n=10）

图4 裸鼠瘤块组织和肝组织中RGS17 mRNA 的表达

图5 瘤块组织和肝组织RGS17 mRNA 表达散点图

3 讨 论

肝癌在所有癌症中为高发肿瘤，在男性人群中排名第5 位，在女性人群中排名第7 位[3]。世界范围内每年约有60 万人死于肝癌，其在发展中国家发病率较高[4]。因此，目前对于肝癌发病机制的研究以及据此制定相应的预防、诊断和治疗策略，成为世界范围内迫切需要研究的重要课题。

G 蛋白位于细胞膜的内表面，是细胞膜表面受体和细胞内效应器的连接桥梁[5]，可调节下游效应器如腺苷酸环化酶信号通路的活性[6]。G 蛋白信号通路在正常肝细胞的生长和再生中起重要作用[7]。在肝细胞癌患者和动物模型中G 蛋白的表达和功能失常。有文献报道，G 蛋白偶联受体87（GPR87）可促进肝癌细胞的增殖和迁移[8]；GPR 5 在肝癌细胞表达异常，参与调节肝癌细胞的表型和生存[9]。除上述G 蛋白、GPR 在肝癌的相关研究外，RGS 逐渐被纳入人们的研究视线[10]。

RGS 调节G 蛋白信号转导的频率和持续时间、细胞内RGS蛋白的分布和活性决定G 蛋白信号转导的效率以及不同G 蛋白信号转导通路间的平衡调节[11]。已发表的关于RGS 的研究大多局限在神经系统[12]，而在其他主要器官如肝脏的研究少见。最近有学者研究发现，RGS5 通过促进肝癌细胞从上皮到间质的转化来促进肝癌的转移[13]；RGS19 则可以抑制RAS 诱导的肿瘤形成和转移[14]。

本研究以RGS17 为研究切入点，在体外细胞株和裸鼠动物体内2 个层面发现其在肝癌细胞中表达上调，提示RGS17 可能参与肿瘤的发生和发展，与其他RGS 参与肿瘤的报道互为印证，为肝癌发病机制的研究提供了新的思路，为肝癌的预防和治疗提供了新的分子靶点。但有关RGS17 促进肝细胞癌发生发展的具体机制和调节功能尚需进一步研究。

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