人工湿地（SEEP）中重要微生物基因的分布

宋成+安德烈欧格母

摘 要：该论文旨在调查人工湿地SEEP的生态效益和影响。SEEP是与蓄水池相关的雨水生态建设项目的简称。该蓄水池具有不可否认的价值，但是却长期被人们忽视。经过集中调查研究之后，发现这和整个环境具有联系。例如，（1）产生数吨温室气体。（2）处理受污染的水源，例如从水中清除N和P资源。（3）关于碳、氮和硫循环的其他生态有利影响。因此，非常值得探索其功能并建立对湿地功能非常重要的基因分布基准线。该文通过使用DNA提取和PCR技术对SEEP中每个区划的不同基因种类（例如，dsrB、mcrA、nirK、nirS和amoA基因）进行了研究并将在此进行报告。

关键词：SEEP  人工湿地  dsrB基因  mcrA基因  nirK  nirS基因和amoA基因

中图分类号：X17 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）11（a）-0119-03

湿地是一片无论是永久性还是季节性都充满水的区域，因此总是呈现出明显的生态系统特征。湿地与陆地最重要的区别就是湿地有还原性土壤，支持水生植物生长。

由于湿地对动植物和人类有至关重要的好处，成千上万的生态学家对湿地进行了无数次研究，即使人们过去认为湿地毫无用处，但是现在人们对该系统优势的认识正处于热火朝天的趋势。湿地巨大的、不可或缺的价值包括：

（1）具有商业价值的鱼类栖息地。

（2）地下水补给。

（3）休闲机会，例如疗养。

（4）美学价值。

（5）改善水质。

（6）厌氧区域的研究价值。

在地球上，有几种微生物对碳循环、氮循环和硫循环相关的生态系统具有重要的作用。

至于碳循环，湿地可以作为蓄水池储存非完全氧化碳源或产生甲烷和其他温室气体。

硫酸盐还原菌（SRB）可以对重金属的直接和间接降解进行调解并有助于有机污染物进行生物降解（3）。因此，使用这些细菌处理径流水非常有利。SRB还可以将硫酸盐异化作用和异养碳降解或二氧化碳固定进行结合，碳酸盐还原会直接影响湿地中的碳循环（17）。对于我的项目来说，我将更加关注相关基因的相对丰度。在这些细菌中所发现的普通基因是dsrB（异化酸性亚硫酸盐还原酶）基因。我将通过对比这种基因的浓度发现人工湿地的特殊功能。至于其他功能，他们对产甲烷的降解途径所涉及的含微生物的酶作用物的竞争非常有利（4）。这意味着这些含dsrB基因的细菌也可能参与了产甲烷菌作用。关于湿地甲烷通量的硫酸盐还原作用在将来有望进一步扩展。

产甲烷菌是地球碳循环过程中的一种必要成分。他们可以在使用氢进行二氧化碳降解或转移甲基化混合物之前进行厌氧催化产生甲烷。有一种酶能够刺激受辅酶-M（被称为甲基辅酶-M还原酶（MCR））束缚的甲基还原。这种酶能够调节甲烷产生路径中的目标过程（10）。在特定环境中，例如高pH或高温环境，人们认为这种受产甲烷菌支配的酶种类繁多。这个因素可能影响湿地SEEP的生态系统（2、10、）。所以，我只选取了mcrA基因作为本项目的目标基因，调查是否任何区划都能产生与其他循环和生物作用相结合的甲烷。

至于氮循环，由于湿地近似于还原环境，用于处理受污染的城市径流水，因此我选取了脱氮菌作为研究目标。这指的是水中氮源的降解。现在也有一些详细说明脱氮作用基因的论文。我选取了nirK和nirS（亚硝酸还原酶）基因进行试验。脱氮是一种厌氧过程，因为我们需要足够的水覆盖土壤。这个过程也结合了其他循环。

最后一种我所感兴趣的基因就是amoA（氨单加氧酶）基因。这种基因在湿地中不容易发现，因为含有这种基因的微生物通常生活在含氧环境中。其他科学家已经提纯出了一种将单加氧酶特有遗传密码编入亚硝酸单胞菌物种中的特殊缩多氨酸，并且我可以从其他论文中获取这些内容（8）。这些细菌可以调解硝化作用中的一个非常重要的步骤（6）并参与甲烷和一氧化碳循环过程（8、9和10）。除此之外，他们还降解有机物，减少臭味（6）。我们最近发现越来越多的环境科学家在进行厌氧环境中微生物的研究（9）。这也是选择这种基因的最重要的原因。

1 研究方向

雨水生态建设项目（SEEP）开始于1995年，用于在自然区和教学实验室（NATL）范围中其所在地内的研究和教育。从根本上说，这是一个人工湿地，用于处理污染水并在深贮水池中存储淡水。

雨水径流指大暴雨时或之后从土地中流走的水。这种径流会造成大量污染物流入河流、湖泊或土壤下方的地下水中。在暴雨中流走的污染物的类型和来源包括：重金属、悬浮体、氯化物和其他化学成分，例如碳氢化合物（9）。这些污染物会极大地影响水体的质量和相关生态系统。在城市化地区（例如，大都市），每天都会产生大量废弃物，如垃圾、油料和重金属。这些污染物污染了水下的土壤。这些土壤通过生物富集会对人类或其他动物产生不利影响。SEEP能够收集一些城市地区的暴雨径流水，缓慢排放，从而减少洪水泛滥的可能性，因此SEEP在处理这个问题方面起到了至关重要的作用。

这也是一个管理计划，在佛罗里达大学自然区和教学实验室（NATL）所在地增加一个雨水贮留池进行生物多样性研究（尽管所列物种相对于自然湿地来说远远不够），同时优化贮水池在研究和教育方面的用途。淡水湿地也在产生优先的温室气体甲烷和其他碳化气水源，但是淡水湿地同时又起到了碳沉积作用（10）。湿地中的水下环境是厌氧的，因此一些湿地促使或帮助厌氧生物存活下来，并通过提供充足的养分使它们发挥作用。这是指产生甲烷和一些发酵产物，例如丙酸盐、丁酸盐、醋酸盐和酵类。

SEEP可分为三个区域：（1）单元I，即前池，其作用是对受污染最严重的雨水进行预处理，（2）单元II，其作用是对受污染比较严重的雨水渠进行二线处理，（3）单元III，这是深淡水池的所在地。endprint

本研究旨在找到适用于氮循环（对氨单加氧酶进行编码）、硫循环（硫酸盐还原）和碳循环（甲烷产生和甲烷氧化）的基因。

根据佛罗里达大学环境保护研究委员会2005-2015年总体综合规划，尽管已经证明了SEEP多方面的好处，但是还未充分了解潜在危害径流的影响，因此需要进一步研究。总而言之，未来研究中充满挑战，这也是我选择将其作为毕业论文题目的原因。我所需要完成的就是提供一个SEEP的轮廓框架，说明某些微生物中基因相对丰度分布。从而使本论文对将来其他进一步的研究起到引导作用。

2 研究目的

该论文的目的是绘制出SEEP在这些方面的整体框架。

2.1 碳循环

SEEP不同区划中参与碳循环的基因的相对浓度。

2.2 硫循环

SEEP不同区划中参与硫循环的基因的相对浓度。

2.3 氮循环

SEEP不同区划中参与氮循环的基因的相对浓度。

3 研究假设

这个区域可能存在各种各样的氮化物，例如，含有amoA基因的亚硝酸单胞菌只能在含氧环境中生存，我认为amoA基因的浓度应该从T1降低到DM1，或者根本没有amoA基因。

我应该在所有区域都找到mcrA基因。用于SM1和SM2都属于厌氧环境，因此在其中应该能找到大量mcrA基因。一些细菌群可以和其他厌氧菌一起生存，是因为他们需要利用厌氧菌，从厌氧菌中获得发酵产物存活下去。

至于dsrB基因，所有区域应该都含有。

在所有区域（除B1和B2以外）都能找到脱氮原核生物，因为这些种类的细菌需要厌氧环境，例如水下土壤。相关基因有nirK和nirS。

4 材料和方法

4.1 采样

这次采样之旅的带头人是Clark博士、Alex Rozin、Elise Morison和湿地俱乐部的学生。我们从2013年10月20日开始搜集材料。所需要的工具包括去心器、容器、过滤器、活塞、刀子、袋子、冷干冰、样品勺、记号笔、数据表、铅笔、带夹子的写字板、地图、水桶、木槌和手套。我们起初需要将去心器埋入土壤，然后取出来。我们有一个活塞用来将有机质土壤从去心器中挤到一个有刻度的容器中。最终将土壤转移到塑料袋中，充分混合。之后，再次重复，挖出更深层的土壤。通过土壤颜色就很容易区分矿质土壤和有机土壤。有机土壤的颜色深，但是矿质土壤的颜色十分浅。我们只需要有机土壤。

我们有11个区域。我们从每个区域收集了3份土壤样品，我们贴上了X-1、X-2和X-3标签（例如T-1，我们有T1-1、T1-2和T1-3），而DM1，我们只收集了一份样品。对于深度，每个核心由于其所含的有机物质量不同而有很大的差异，我们从T1-3中收集了2个深度范围。一个是0～2 cm;另一个是2～16 cm。但是对于T2-3，我们所收集的范围是0～2 cm和2～7 cm。收集样品之后，我们将其储存在了-80℃的冷冻箱中。除非深度在0～2 cm，否则收集不到矿质土壤。（我们有了有机质深度的数据，在0～2 cm深度范围，这些有机质样品有一些矿质土壤）

在进行DNA提取之前，第一步是在研钵中将液氮用槌磨碎，磨得越碎越好。然后将土壤样品变成粉末。

4.2 DNA提取

使用PowerSoil DNA Isolation Kit进行DNA提取。附件A中列出了更加详细的信息。

下列步骤是通过凝胶电泳检查结果。对于这个过程，我先制作了一瓶凝胶。凝胶的配方如下：

（1）找到一个合适的瓶子。

（2）称3g琼脂糖凝胶。

（3）将所称的琼脂糖凝胶添加到瓶子中。

（4）添加200 mL TAE（0.5倍）。

（5）加热，直到所有固体溶化。

（6）添加2.5 μL/200 mL溴化乙锭。

然后，我需要等凝胶冷却，准备运行电泳。等到凝胶变得有一点热的时候，将凝胶倒入容器中并添加0.5倍TAE缓冲。将电泳机器调整到120 V并运行20 min。之后，我将凝胶取出，放到紫外光下进行曝光，然后查看结果。

4.3 聚合酵素链锁反应

聚合酶链反应扩大我所需要的基因。附件B中列出了聚合酶链反应试验计划的详细内容。为了证实不是由于含有目标DNA的缓冲池或试剂导致扩大，需要一份阴性PCR对照样品。阴性对照仅包括自分解水、引子和Gotaqs（使用水取代DNA）。

同时，还需要进行阳性对照。以下是进行标准阳性对照的步骤（只选了dsrB基因作为例子）。

（1）从Elise（我们实验室的一名博士研究生）处获得LB KAN盘，加热到37 ℃。

（2）使用活化环从Elise的4盘中记录dsrB克隆数76。

（3）将克隆品放到LB KAN盘上，并使用曲棍使其散开。（LB KAN是含有抗菌卡那霉素的培养基，将1 mL备用卡那霉素添加到1L热压处理过的LB琼脂中而得到）。

（4）放在37 ℃环境中培养2 d。

（5）取出Elise的LB KAN液体培养基，取出500 μL液体培养基，用移液器吸到盘子上，将生物质擦除，让他们悬浮在500 μL液体培养基中。使用2转每分钟的速度分离10 min。

（6）至于下列步骤，请参见QIAprep Spin Mini Prep Kit（目录册# 27104）。

最后一步是为了检查标准dsrB基因的浓度。城市径流水从T1流向DM1，从未处理的水变成干净淡水。T2是另一个处理受污染水的区划，但是有一个截水沟阻止了水从T2流向DM1。但是，边缘很少涉及到这个系统。市径流水从T1流向DM1，从未处理的水变成干净淡水。T2是另一个处理受污染水的区划，但是有一个截水沟阻止了水从T2流向DM1。但是，边缘很少涉及到这个系统。城市径流水从T1流向DM1，从未处理的水变成干净淡水。T2是另一个处理受污染水的区划，但是有一个截水沟阻止了水从T2流向DM1。但是，边缘很少涉及到这个系统。城市径流水从T1流向DM1，从未处理的水变成干净淡水。T2是另一个处理受污染水的区划，但是有一个截水沟阻止了水从T2流向DM1。但是，边缘很少涉及到这个系统。城市径流水从T1流向DM1，从未处理的水变成干净淡水。T2是另一个处理受污染水的区划，但是有一个截水沟阻止了水从T2流向DM1。但是，边缘很少涉及到这个系统。endprint

5 结语

采样可能存在一些问题。从结果来看，对于每个基因聚合酶链反应过程，每个区划的3个复制品的环境应该几乎一样。但很明显，情况并不是这样。我从Elise处得知，一些样品不是从潮湿土壤中获得的。由于是自然系统，这当然可以理解。在单个位置，不同的采样位置之间也是各不相同的。这种变量并不意外。因此，我选择计算平均值，取得更好、更合理的结果。

至于DNA提取产物，我们可以发现，我是从所有区划中获得DNA的，因此我可以继续下列聚合酶链反应过程。在他们所包含的有机物中他们的浓度各不相同。我仅对需要进一步试验的区划的几个DNA运行了电泳。DNA的数量能够反映出有多少有机物。即使对于相同深度，即0～2 cm，我们发现他们的有机物丰度也是不同的。由于有氧环境的消费率比厌氧环境的消费率高，因此厌氧环境DNA平均质量高于有氧环境DNA平均质量。他们可以被完全氧化，但是却无法积累足够的有机物。我只在dsrB基因中遇到了一些污染物问题，但是相对于阳性对照和样品来讲，这些污染物微不足道。

dsrB基因的结果是合理的。我们看到T1的dsrB基因丰度最大，紧接着是T2等。这非常适合将城市径流水冲干净。含有这种基因的微生物能够降解受污染水中的硫化源。减少细菌的亚硫酸盐所需的环境非常复杂。这种环境可能是浸水也可能是水流波动。他们还能和其他细菌（例如，产甲烷菌）互养，这样产甲烷菌可以利用这些非完全氧化碳源或氢产生甲烷。很明显，mcrA基因能和dsrB基因结合主要是为了互养。含有mcrA基因的细菌或古生菌需要持续的浸水状态，这就意味着完全缺氧环境。根据每个区划的水深，我所获得的结果是可以理解的。SM1和E2非常接近深水沼泽DM1。因此，他们也需要大量mcrA基因。

NirS和nirK微生物更喜欢波动的浸水环境，例如SM1和SM2。

尽管NirS基因和nirK基因的作用几乎是一样的，但是NirS基因的丰度低于nirK基因的丰度。SEEP中种类各异的脱氮物种可以解释这种情况。一些物种的nirK基因可能比NirS基因多。

amoA基因的结果似乎比较复杂，但是我从另一篇论文中了解到了amoA基因的正确序列和尺寸（10）。由于不同区划拥有不同类别的化学无机营养氨氧化菌，我因此得出我的结果是有意义的。这也是这些波段的主要原因。非常有趣的是，我们发现即使在深沼泽处也有大量amoA基因。下面就是对此的解释。在深沼泽处，有一种植物拥有通气组织。这种植物组织能够将外部的氧传送到根部周围，这样一些蓄养细菌就可以在这个地方生长。因此，DM1的amoA基因浓度高也就可以理解了。其作用和拥有高浓度的C2相同。

这些基因可以组成一个很长的湿地生物链。在深土壤地带，薄壁组织可以传送氧，并将氧提供给氨氧化菌。氨氧化菌会将氨盐基转化成硝酸盐并将其释放到周围的土壤中。大多数地点都是厌氧的，并远离植物根部。这些脱氧菌会通过将硝酸盐转化成亚硝酸盐（NO3andNO2）而获得养分。他们还能和产甲烷菌结合。这些细菌在获取养分时，他们还能去除水中氮物质。

我的SM1-1土壤样品仍然没有获得基因聚合酶链式反应扩增的结果。这也是有可能的，因为该样品中一些抑制因子组织了聚合酶链式反应扩增，例如Taq聚合酶抑制剂。

参考文献

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