翟 兴 礼
(商丘师范学院 生命科学学院,河南 商丘 476000)
夹竹桃(Nerium indicum),又名柳叶桃、半年红,属夹竹桃科,夹竹桃属.具有抗烟雾、抗灰尘、抗毒物和净化空气、保护环境的能力.夹竹桃是最毒的植物之一,包含多种毒素,有些甚至致命.夹竹桃很少有病虫害,而且其叶、枝、根都可以用于杀虫[1].夹竹桃全株有毒,其毒性成分主要是强心甙类物质(异热马酮、烟酰异热马酮、洋地黄毒甙元、厚果酮等).熊英年等曾利用夹竹桃治疗畜禽寄生虫病300 多例[2].还发现夹竹桃提取液能用于消灭钉螺[3]以及抑制茭白二化螟[4]和线虫[5]的生物活性.
研究发现,夹竹桃对一些细菌具有抑菌作用.李萍、谭芸、龚枕等曾利用夹竹桃研究其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等受试菌种的抑菌作用,结果表明其均有不同程度的抑菌作用[6].陆宁海、吴利民、李晓红等以玉米小斑病菌、小麦纹枯病菌等植物病原菌作为受试菌种,研究夹竹桃的抑菌性,实验结果表明其对植物病原菌具有抑菌作用[7].本实验以巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌作为受试菌种,采用滤纸片贴片法实验,以产生的抑菌圈直径大小作为抑菌效果大小的衡量尺度,进行夹竹桃叶提取液的抑菌作用研究.以期为夹竹桃的充分、合理的开发利用提供参考.
1.1.1 夹竹桃叶的选取
一般于5月下旬至6月中旬,取夹竹桃枝条上部嫩叶片或枝条顶端嫩芽,汁液较多也方便磨碎.试验用夹竹桃采自商丘师范学院中心花园.
1.1.2 供试菌种
巨大芽孢杆菌(bacillus megatherium)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis),购于中国农业科学院.
1.1.3 培养基
牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏,蛋白胨,NaCl,琼脂粉).
1.1.4 实验仪器
高压蒸汽灭菌锅,恒温培养箱,电子天平,研钵,三角瓶,小试管,培养皿,圆形滤纸片(6 mm)等.
1.2.1 培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基[8]:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,琼脂粉20 g,水1000 mL,pH 7.4-7.6.将各种物质加入水中加热溶解后,分装于5 个250 mL 的锥形瓶中,灭菌后备用.
1.2.2 夹竹桃叶提取物的制备
取夹竹桃叶,用自来水洗净后用蒸馏水冲洗,晾干页面水分,称取15 g 于紫外灯下照射20 min[12].放入灭菌后的研钵中,放适量石英砂于其中,研磨后,加5 mL 无菌蒸馏水浸泡1 h.用四层无菌纱布过滤并挤压,即得夹竹桃提取液.
夹竹桃水提取液的浓度=夹竹桃叶的质量(鲜重)/叶重+加入水的体积,此时该提取液浓度为75 %.再将75 %的夹竹桃用无菌蒸馏水稀释成50 %,25 %,5 %三个浓度,即得到75 %、50 %、25 %、5 %四个提取液浓度梯度,置于冰箱中保存备用.
1.2.3 提取液滤纸片浸制
将经过干热灭菌的小滤纸片(6 mm)分别放入各浓度的夹竹桃叶提取液中,充分浸泡2 h.
1.2.4 受试菌液的配制
将低温保藏的巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌进行斜面活化24 h.分别用接种环挑取四环活化后的菌落,加入装有10 mL无菌水的小试管中,充分震荡使菌体散开,制成菌悬液备用.
1.2.5 抑菌实验
分别用加液枪取两种菌悬液0.5 mL 加入到牛肉膏蛋白胨固体培养基上,用涂布棒涂匀.正置30 min 后,将用各浓度夹竹桃提取液浸泡后的滤纸片小心均匀放置到带菌的培养基平板上,每皿放相同夹竹桃叶提取液浓度的4 片滤纸.每个浓度提取液做3 个重复实验;对照组两种菌种各做1 个.放入37 ℃恒温培养箱中倒置培养24-48 h,观察有无抑菌圈出现,测量抑菌圈直径大小,求其平均数.
以巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌为受试菌种,利用4 个浓度梯度的夹竹桃叶提取液来进行抑菌实验,测量抑菌圈直径大小,具体抑制情况见表1.
表1 夹竹桃叶提取液对巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径(mm)Table 1 Circle diameter of Bacteriostasis effert of water extract from Oleander Leaves on bacillus megatherium
抑菌实验的结果显示,4 个浓度的夹竹桃叶提取液对巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌均有不同程度抑制作用.高浓度的提取液具有明显的抑菌圈出现,抑菌效果明显;随着其浓度的降低,抑菌圈的直径减小,抑菌程度减弱.
根据以上实验结果,夹竹桃叶提取液对巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均具有杀菌作用.75%的夹竹桃叶提取液对巨大芽孢杆菌的最大抑菌圈直径为10.25 mm,对枯草芽孢杆菌的最大抑菌圈直径为9.0 mm,较前者小一些,比较夹竹桃叶提取液对两种受试菌种的抑制作用,其对巨大芽孢杆菌的抑制圈均比对枯草芽孢杆菌的抑菌圈大;这表明,相同浓度的夹竹桃叶提取液对巨大芽孢杆菌的抑菌效果要比对枯草芽孢杆菌的要高一些.
对于夹竹桃的抑菌作用研究,李昌灵、牛友芽、刘胜贵曾用不同溶剂进行夹竹桃叶提取液的抑菌实验;结果表明,夹竹桃叶的70%乙醇提取液的抑菌效果最为明显[9].同时,谭宏亮、黎鹄志将夹竹桃叶进行加热干燥后,蒸馏水煮沸提取,浓缩后制得提取液进行抑菌实验,也收得较好的实验结果[10].本实验以蒸馏水直接浸泡提取夹竹桃有效成分,进行抑菌实验,具有一定的抑菌性;但较之李昌灵、牛友芽、刘胜贵所做的实验结果相比,抑菌效果较差.说明不同提取方式对夹竹桃有效成分的提取效果不同.蒸馏水直接提取效果不佳,可能是用水直接提取有效成分不能充分提取出来,进而造成抑菌效果不理想.
夹竹桃以其剧毒性,在杀虫杀菌方面具有较大作用.同时其有效成分具有治疗心脏病、心力衰竭、闭经的作用.生物体内的免疫系统非常复杂,因此一种药物对机体的杀菌作用效果及杀菌机理都有待进一步进行体内实验研究.本实验是进行的体外实验,为夹竹桃的进一步开发利用提供理论依据.
[1]沈宦初,张一宾.生物农药[M].北京:化学工业出版社,2000.
[2]熊英年,张吉英,李德山.夹竹桃的杀虫作用[J].中兽医学杂志,1997(4):41.
[3]曾永钢,唐万鹏,胡兴宜等.钉螺对夹竹桃强心总甙毒理作用的反应[J].科技创新导报,2010(19):128-129.
[4]郑许松,俞晓平,吕仲贤,等.夹竹桃叶提取物对茭白二化螟的生物活性[J].浙江农业学报,2003,15(3):167-171.
[5]王猛,曹福祥,滕涛.夹竹桃提取物对松材线虫致死性的研究[J].湖南林业科技,2000,33(6):7-8.
[6]李萍,谭芸,龚枕,王智.夹竹桃叶提取液的抑菌作用研究[J].湖南农业科学,2009(11):94-95.
[7]陆宁海,吴利民,李晓红,等.夹竹桃抑菌活性的初步研究[J].湖北农业科学,2007,46(6):934-935.
[8]沈萍,范秀荣,李广武.微生物学实验(第三版)[M].北京:高等教育出版社,2006.57-58,100-103.
[9]李昌灵,牛友芽,刘胜贵.夹竹桃叶提取物的抑菌作用研究[J].安徽农业科学,2008,36(2):575-577.
[10]谭宏亮,黎鹄志.夹竹桃叶水提取物抑菌作用研究[J].宜春学院学报,2007,29(4):70-71.