樟芝提取物Fr.2组分对PDGF-BB活化CFSC-8B的抑制作用

王 静， 耿 燕， 孙 青， 陆震鸣， 许正宏， 史劲松

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

肝纤维化是指许多慢性肝脏疾病发病过程中由各种致病因子所致肝内弥漫性细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）过度沉淀的病理过程[1]，进一步发展为肝硬化、肝衰竭，往往需要肝移植来根治。但由于器官来源严重短缺，许多病人在等待器官过程中死亡，这已成为我国一个重要的公共卫生问题[2]。

目前的研究认为，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是正常及纤维化肝脏中ECM的主要合成细胞，HSCs增殖与凋亡的失衡是肝纤维化发生的细胞生物学基础[3]。研究表明，多种细胞因子参与肝纤维化的发生，血小板衍生生长因子（PDGF）是强大的促HSC增殖因子，PDGF以自分泌、旁分泌的方式参与HSCs活化，且有很强的促纤维生成作用，可以显著促进I型胶原合成[4]。

樟芝（Antrodia cinnamomea）[5]是一种仅分布在我国台湾地区的珍稀担子菌。据国内外文献报道，樟芝子实体及菌丝体中含有众多生理活性物质，如三萜类化合物、多糖、SOD、腺苷、小分子蛋白质及固醇类物质等[5]。现代药理研究已证实，樟芝子实体及其发酵产物在保肝[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]方面具有独特的功效。樟芝深层液态发酵产物的粗提取物已被证实对CCl4诱发的肝损伤及肝纤维化节结和二甲基亚硝胺（DMN）造成的肝纤维化都有明显的阻碍作用[6，9]，但是其活性组分及作用机制研究还未见报道。

笔者前期从樟芝菌粉中分离得到Fr.2组分，具有较强的抗肝纤维化活性，但其作用机制还需进一步研究。水飞蓟宾（Silybin）是从水飞蓟种子的种皮中提取所得的一种黄酮化合物，具有抗肝纤维化活性[10]。因此，本实验中以Fr.2为研究对象，以Silybin为阳性对照物，通过构建PDGF-BB活化的CFSC-8B细胞模型，检测Fr.2对PDGF-BB刺激的CFSC-8B细胞增殖及迁移效果，探讨其抗肝纤维化的作用机制，旨在为深入研究樟芝防治肝纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 器材

1.1.1 材料与试剂 樟芝菌粉购自金颖生物科技股份有限公司，樟芝菌粉采用甲醇浸提，正己烷-水以体积比1∶1萃取，将正己烷萃取物通过硅胶柱色谱进行层析，获得组分Fraction2（Fr.2），用于开展抗肝纤维化研究；RPMI-1640培养基，胎牛血清（FBS），购自美国Gibco公司；胰酶-EDTA消化液，青霉素，链霉素，购自碧云天公司；Silybin及MTT，购自美国Sigma公司；WST-1细胞增殖试剂盒，TRIZOL，FastStart Universal SYBR Green Master，细胞裂解液，购自美国Roche公司；MAPK信号通路抗体，购自Cell Signaling Technology公司；其余试剂为分析纯，购自国药集团化学有限公司。

1.1.2 实验细胞 大鼠肝星状细胞株 CFSC-8B，购自中南大学湘雅中心实验室细胞库。细胞培养液为RPMI-1640培养基，内含质量分数10%FBS、青霉素和链霉素，在37℃，质量分数5%CO2的培养箱中培养，细胞汇集至80%时进行传代接种，选取对数生长期细胞进行实验。

1.1.3 仪器 EL204电子天平，博特勒托利多公司制造；MULTISKAN ASCENT酶标仪，赛默飞世尔仪器有限公司制造；CO2培养箱，Thermo公司制造；倒置显微镜，Nikon公司制造；PCR扩增仪，Bio-Rad公司制造。

1.2 方法

1.2.1 体外PDGF-BB诱导的CFSC-8B细胞增殖模型的构建 将处于对数生长期的CFSC-8B细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板，24 h后用含有体积分数0.5%FBS的培养基饥饿细胞24 h，加入不同质量浓度的 PDGF-BB （0、5、10、20 ng/mL），每组设 6个复孔，分别作用 24、36、48、72 h后，每孔加入10 μL WST-1，在细胞培养箱中作用1 h后，用酶标仪检测450 nm的OD值，参考波长为690 nm。

1.2.2 MTT法检测细胞活性 将CFSC-8B细胞以3×103个/孔的密度接种于96孔板，37℃培养24 h后，加入Fr.2组分，使每孔终质量浓度分别为3、6、12、25、50、100 μg/mL，每组设 6 个复孔，分别作用24、36、48、72 h 后，每孔加入 5 mg/mL 的 MTT 溶液10 μL，继续培养4 h后小心吸去孔内培养液，加入150 μL DMSO，震荡10 min使紫色结晶充分溶解，在酶标仪上测570 nm处OD值[11]。通过公式（2）及Graphpad软件计算细胞存活率及IC50值。

1.2.3 细胞划痕法检测细胞迁移 调整对数期CFSC-8B细胞悬液浓度至3×105个/mL，以每孔1 mL细胞悬液接种到6孔板内，待细胞生长至90%～100%融合度时，以体积分数0.5%FBS饥饿细胞24 h。用200 μL枪头垂直插入孔中划痕。PBS洗涤细胞，加入含有体积分数0.5%FBS培养基配制的不同质量浓度的 Fr.2 溶液及 Silybin（25 μmol/L）。每隔一定时间对细胞取样拍照，使用Image J软件计算划痕面积，以划痕面积的变化值定义细胞迁移率。

1.2.4 细胞小室迁移实验检测细胞迁移 Transwell小室滤膜为8 μm孔径的聚碳酸酯微孔滤膜（Millipore公司），调整对数生长期悬液浓度至2×105个/mL，加入 100 μL 于上室，将 Transwell小室放入预先加入500 μL含有体积分数10%FBS细胞培养基的24孔板中。加入不同质量浓度的Fr.2及Silybin（25 μmol/L）后继续在培养箱常规培养 24 h。取出滤膜，用棉签擦去上室滤膜内表面残存细胞，对迁移至滤膜外表面的细胞用质量分数4%多聚甲醛固定，PBS洗涤，质量分数0.1%结晶紫染色，用体积分数33%醋酸脱色抽提10 min，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液在酶标仪上于570 nm处测定OD值，间接反映细胞数。

1.2.5 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测相关基因表达情况 采用TRIZOL法，按试剂盒说明书提取总RNA，将RNA逆转录为cDNA，采用SYBR Green进行荧光定量PCR反应。采用2-ΔΔCt法对α-SMA、Collagen I （Col 1）、Collagen Ⅲ （Col 3）和Fibronectin（Fn）基因的表达水平进行相对定量，计算各相关基因的表达倍数[12]，相关基因引物序列采用文献[13-14]所述。

1.2.6 蛋白质印迹（Western Blotting） 用4℃预冷的PBS洗涤细胞，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的总蛋白质抽提试剂，于冰上裂解30 min，超声处理30 s以降解DNA。裂解产物在4℃下12 000 g离心10 min后得到细胞蛋白质上清液，采用BCA蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。经SDS-PAGE电泳后在冰浴条件下将凝胶上的蛋白质电转移至PVDF膜（Millipore公司）上，分别孵育一抗和二抗。ECL试剂盒（Thermo Scientific）显色，利用Image J软件分析蛋白质条带灰度值。

1.2.7 数据统计 根据One-Way ANOVA统计学处理实验结果，结果用平均值±标准差（mean±SD）表示，极显著水平为与对照组比较##P＜0.01，与PDGFBB诱导组比较**P＜0.01。

2 结果与分析

2.1 体外PDGF-BB诱导的CFSC-8B细胞增殖模型的建立

由表1可知，5～20 ng/mL范围的PDGF-BB可诱导CFSC-8B细胞增殖，与对照组相比，差异极显著（**P＜0.01），呈现剂量及时间依赖性。PDGF-BB 20 ng/mL和10 ng/mL促增殖作用相比差异不显著，所以选择10 ng/mL PDGF-BB作用CFSC-8B细胞48 h为最佳细胞增殖模型。

表1 PDGF-BB质量浓度和孵育时间对CFSC-8B细胞增殖率的影响Table 1 Proliferation effect of PDGF-BB on CFSC-8B cells，Proliferation %

2.2 Fr.2对CFSC-8B细胞生长的影响

如图1所示，不同质量浓度的Fr.2作用CFSC-8B细胞不同时间后，细胞存活率受到不同程度的抑制。细胞存活率随着作用时间及Fr.2质量浓度增加而呈逐渐下降趋势，Fr.2在0～12 μg/mL范围内对CFSC-8B细胞存活率无明显抑制，其细胞存活率均在90%以上；但在高质量浓度的Fr.2作用下，CFSC-8B细胞出现了较多的死亡，表现出明显的细胞生长抑制效应，本实验中选定Fr.2 0～25 μg/mL的范围与CFSC-8B细胞孵育48 h进行后续研究。通过Graphpad分析得出Fr.2与CFSC-8B细胞共孵育 48 h的 IC50值为 56.46 μg/mL。

2.3 Fr.2对PDGF-BB诱导CFSC-8B细胞增殖的影响

采用体外PDGF-BB诱导CFSC-8B细胞增殖模型，检测了Fr.2对PDGF-BB刺激的CFSC-8B细胞增殖的影响（图2），10 ng/mL PDGF-BB可极显著诱导 CFSC-8B 细胞增殖（##P＜0.01），而 6、12、25 μg/mL Fr.2可极显著抑制PDGF-BB诱导的CFSC-8B细胞增殖（**P＜0.01），且具有剂量依赖性，其中 25 μg/mL Fr.2的抑制率为71.8%，这与阳性对照Silybin（25 μmol/L）的抑制率（70.8%）相当。

图1 Fr.2对CFSC-8B细胞存活率的影响Fig.1 Effect of Fr.2 on the cell proliferation in CFSC-8B cells

图2 不同质量浓度Fr.2对于PDGF-BB诱导的CFSC-8B细胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Fr.2 on the cell proliferation induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

2.4 Fr.2对PDGF-BB诱导CFSC-8B细胞迁移的影响

HSCs向肝内炎症区域迁移，可导致炎症区域活化的HSCs数目增多，加重病灶局部的纤维化程度。所以，如能抑制HSCs在肝损伤时向炎症区域迁移，就可能干扰或减轻纤维化进程。

细胞划痕实验显示，各实验组中CFSC-8B细胞从划痕边缘向划痕内迁移，24 h后迁移的细胞呈单层铺路卵石样排列（图3（a））；与对照组比较，计算各区域细胞迁移率（图3（b））。结果表明，PDGF-BB刺激24 h后，细胞迁移的距离明显高于对照组（##P＜0.01），Fr.2（6、12、25 μg/mL）与 PDGF-BB 细胞共孵育组细胞迁移率显著低于PDGF-BB组（**P＜0.01），说明一定剂量的Fr.2可抑制PDGF-BB诱导的细胞迁移。

图3 不同质量浓度Fr.2对于PDGF-BB诱导的细胞划痕损伤的作用Fig.3 Effect of Fr.2 on the cell scratch wound induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

细胞小室迁移实验进一步验证了Fr.2对PDGF-BB诱导CFSC-8B细胞迁移有抑制作用，结果如图4所示。

PDGF-BB可显著诱导CFSC-8B细胞迁移，与对照组相比差异极显著（##P＜0.01）。Fr.2可显著抑制PDGF-BB 诱导的 CFSC-8B 细胞迁移（**P＜0.01），呈现剂量依赖性。25 μg/mL Fr.2细胞迁移抑制率为65.0%，而25 μmol/L Silybin的抑制率为 69.1%，结果表明25 μg/mL Fr.2抑制细胞迁移的效果优于Silybin。

图4 不同质量浓度Fr.2对于PDGF-BB诱导的CFSC-8B细胞迁移的作用Fig.4 Effect of different concentrations of Fr.2 on the cell migration induced by PDGF-BB in CFSC-8B cells

2.5 Fr.2对CFSC-8B细胞肝纤维化相关基因表达情况的影响

在分子水平上进一步检测Fr.2对于PDGF-BB诱导的HSC活化及细胞外基质表达的影响。图5 qRT-PCR结果显示，10 ng/mL PDGF-BB可显著诱导HSCs活化标记α-SMA基因表达，并显著上调细胞外基质 Col1、Col3 及 Fn 基因表达（##P＜0.01）。 而Fr.2 （6、12、25 μg/mL） 显著抑制 PDGF-BB 诱导的α-SMA、Col1、Col3 及 Fn 基因表达（**P＜0.01），且具有剂量相关性（图 5）。

2.6 Fr.2对MAPK信号通路的影响

在明确了Fr.2组分对CFSC-8B细胞增殖、迁移及肝纤维化相关基因表达的抑制作用后，进一步研究了其对PDGF介导的MAPK信号转导途径的影响。

如图6所示，对照组的信号转导途径处于低水平状态，PDGF-BB诱导的CFSC-8B细胞MAPK途径下游信号分子，如磷酸化Extracellular signalregulated kinase （p-ERK）、 磷酸化 c-Jun NH2-terminal kinase（p-JNK），及磷酸化P38 mitogenactivated protein kinases（p-P38），它们的表达较正常对照组明显增强（##P＜0.01）。用Fr.2处理细胞后，PDGF-BB诱导的 CFSC-8B细胞 p-ERK、p-JNK、p-P38 的表达受到抑制（**P＜0.01）。

图 5 不同质 量 浓 度 Fr.2对 α-SMA、Col1、Col3及 Fn mRNA相对表达量的影响Fig.5 Effect of Fr.2 on the relative expression of α-SMA、Col1、Col3 and Fn mRNA

3 结语

图6 Fr.2对 CFSC-8B细胞 p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白质表达的影响Fig.6 Effect of Fr.2 on expression of p-ERK、p-JNK、p-P38 in CFSC-8B cells

过去认为肝纤维化是持续的不可逆的过程，但目前有病例称重度肝纤维化仍可逆转，这极大激发了研究人员从事开发抗肝纤维化药物[15]。通过抑制HSCs活化来控制肝纤维化，已成为医药领域的研究热点。

HSCs是位于Disse间隙的一种间质细胞，正常情况下处于静息状态，经多种细胞因子刺激活化后HSCs大量增殖，合成包括胶原在内的各种细胞外基质，最终导致肝脏内胶原的异常沉积而发展成为纤维化[3]。其中PDGF是重要的促有丝分裂因子，可通过激活MAPK信号通路，促进HSCs增殖和细胞外基质如胶原表达增加[16]。

作者构建了体外PDGF-BB活化的CFSC-8B细胞模型，进一步利用此模型检测Fr.2对CFSC-8B细胞的作用。 结果表明：Fr.2（6～25 μg/mL）能抑制PDGF-BB诱导CFSC-8B细胞的增殖及迁移，且呈剂量依赖性。并显著降低PDGF-BB诱导的α-SMA、Col1、Col3及Fn基因表达水平。

MAPK通路有调控细胞增殖、分化、凋亡及细胞间功能同步化等重要功能，MAPK蛋白质家族包括ERK、JNK和P38[17]。MAPK途径也是HSCs中重要的细胞内信号转导途径。研究显示，Fr.2可抑制PDGF-BB诱导MAPK信号转导中p-ERK、p-JNK及p-P38表达。由此推测Fr.2可能通过阻止CFSC-8B细胞增殖及向损伤部位迁移，下调细胞外基质的表达，从而阻止肝纤维化的发生，其机制可能与抑制胞内MAPK信号转导通路有关。

对樟芝提取物的Fr.2组分进一步分离，并鉴定其活性化合物的结构，进而研究其抗肝纤维化的机制，将有助于抗肝纤维化药物的研制。

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