奶牛早期妊娠诊断技术的应用

文│张晶 陈奎春 温富勇 赵海明 张利娟（北京市密云县农业局 现代农业产业技术体系北京市奶牛创新团队）

目前北京市密云县大多数奶牛养殖场对奶牛妊娠诊断还采用传统的配种后60天进行直肠触诊法，既浪费人力物力，又增加牛与人之间疾病的传播。2014年4月密云县引进了先进的奶牛早期妊娠诊断技术，使用“28天可视孕检试剂盒”，对配种后28天的奶牛采血样分离血清进行诊断，该技术将奶牛妊娠诊断时间提前了30天，一头奶牛可节省30天的饲养成本，增加奶产量，节约饲料成本，降低了产犊间隔，改善繁殖状况，并减少对妊检人员身体的伤害，避免了人畜传染病的发生。目前，该项技术已在密云县7个奶牛养殖场进行应用，特异性达到了96%以上。本文简述了通过对怀孕奶牛早期产生相关糖蛋白的检测，来判定奶牛是否妊娠的早期诊断方法的操作及对养牛业应用的意义。

表1 早期妊娠诊断技术的准确性实验

一、奶牛早期妊娠诊技术的意义和原理

1.奶牛早期妊诊断的意义。目前，密云县共有奶牛场31家，共有7家使用此项技术，2013年以前密云地区大多数牛场使用的妊娠诊断方法都是直肠触诊法，既浪费人力物力，又增加牛与人之间疾病的传播。

对牛精准及时的怀孕检测在当今的牧场繁殖管理程序中是一项十分重要的内容。兽医和牧场工作人员对牛进行早期怀孕检测，查找出空怀牛，这样可以尽快重配空怀牛以及缩短产犊间隔，从而为奶牛场带来最高的牛奶产量和收益。

传统上，通过对牛进行直肠触诊或超声来诊断牛是否怀孕，一般45～60天以后才能监测出结果。早期妊娠诊断技术，可以早在配种后28天就检测到牛是否怀孕，特异性在96%～99%，该诊断方法为兽医和奶牛场的工作人员提供了检测怀孕牛的重要工具，给养殖户带来很大的经济效益。以1000头规模的奶牛场为例，泌乳牛繁殖率可从75%提高到80%，产间距可以从16个月下降到15个月，空怀天数可以下降30天，即1000头×30天×30元/天＝900000元，将牛群空怀天数下降30天，可以为牧场带来90万元的效益。

表2 久兴奶牛场试验应用情况

2.早期可视孕检的原理。早期可视孕检试剂盒是根据酶联免疫反应原理设计的，用于检测怀孕早期存在于牛血清的怀孕相关蛋白（PAGs），这类蛋白可以作为牛怀孕的标志。微孔板已经包被PAG抗体，将待检样品在包被板上进行稀释并孵育后，捕获到的怀孕相关蛋白（PAGs）可以与特异性的PAG抗体（检测溶液）和辣根过氧化物酶标记物（酶标抗体）结合。未被结合的酶标抗体则被洗掉，随后在孔内加入TMB底物溶液。孔内溶液的颜色深浅与样品中PAG的含量成比例。

二、此项技术在密云地区奶牛场的应用

1.技术操作过程及要求。

（1）采取配种后28天以上奶牛的血样。对配种28天以上奶牛的血样进行分离血清，已备检测。

（2）试验操作程序。

第一步，试剂准备。

在使用之前，所有的试剂盒组分都必须恢复到18～26℃。试剂应通过轻轻涡旋、旋转混合均匀。每个样本都使用不同的吸头。浓缩洗涤液要使用蒸馏水或去离子水进行10倍稀释。

第二步，在酶联免疫吸附剂测定（ELISA）板中加入样品及试剂。

在所有样品和对照孔内滴加一滴样品稀释液。使用试剂盒内提供的移液器和附带的吸头，吸取阴性对照并分别加入两个孔内。吸取阳性对照并分别加入两个孔内。吸取样品（血清）并加入适当孔内。不同样品需更换吸头。轻弹微量反应板将反应板中的溶液混匀，盖好盖板，在18～26℃条件下孵育30分钟（可以有误差2分钟）。洗板：移除盖板，快速翻转反应板，将板孔内液体弃入废液缸或水槽。用装有洗涤溶液的洗瓶洗板3～5次。每次洗涤后快速翻转反应板，弃去洗涤溶液。在最后一次洗涤完后，将反应板在吸水纸上拍干。

第三步，加入检测溶液。

在每个反应孔中加入2滴检测溶液。盖好板盖，在18～26℃条件下孵育30分钟（可以有误差2分钟）。洗板。

第四步，加入酶标抗体。

在每个反应孔中加入2滴酶标抗体。盖好板盖，在18～26℃条件下孵育30分钟（可以有误差2分钟）。洗板。

第五步，加入底物液和终止液。

在每个反应孔中加入2滴TMB底物溶液。在18～26℃条件下孵育15分钟（可以有误差1分钟）。在每个反应孔中加入2滴终止液终止反应。在加终止液时要按加入底物溶液的顺序进行滴加。轻弹微量反应板将反应板中的溶液混匀。肉眼进行读板，对照孔呈蓝色的为阳性。

第六步，读板及结果判定。

动物的怀孕状态是由肉眼观察孔内颜色决定的。如未观察到蓝色，颜色与阴性对照孔颜色相似，则此动物被认为是空怀。如观察到蓝色，则存在PAGs，此动物被认为是怀孕。如样品孔颜色很难用肉眼分辨，则认为可疑/疑似，推荐怀孕复检。

2.应用情况。

（1）为进一步验证该试剂的准确性，在一奶牛场采集奶牛血样17头份，其中包括直肠检查已确定妊娠的奶牛，没配种的空怀牛奶牛和配种后待检奶牛。具体情况如表1。

经检测，其中2头已怀孕奶牛检测结果为阳性，2头未配种的奶牛检测结果为阴性，说明早期妊娠诊断试剂盒的准确率为100%。

（2）应用的效果分析。2014年5月21日对密云县十里堡镇久兴奶牛场的24头待检奶牛进行检测。具体情况如表2。

共检测24头奶牛，其中28～35天采血用早期妊娠诊断试剂盒检测出18头为阳性，6头为阴性，60天直肠检查18头阳性牛中有3头为阴性，阴性的原因有可能为早期胚胎死亡。

三、小结

在现代规模化牧场管理中，提高奶牛终生产奶量，改变牧场繁殖效益是养殖户追求的目标。奶牛终身可以有更多的泌乳高峰，生产奶量的增加，较短的繁殖周期，可以提高繁殖性能和经济效益，这必须通过缩短配种期来实现，这些就需要尽早诊断出已配奶牛是否已经怀孕。奶牛早期可视妊娠诊技术具有操作简便，准确率高，增加奶产量，节约饲料成本等优点，所以此项技术的应用对于养牛业具有重要的意义。