龙胆草对HaCaT细胞增殖和凋亡及表皮生长因子受体磷酸化的影响

娄银飞 马丽俐 郑明警 周慧 方一妙

龙胆草对HaCaT细胞增殖和凋亡及表皮生长因子受体磷酸化的影响

娄银飞 马丽俐 郑明警 周慧 方一妙

目的探讨龙胆草提取物对表皮生长因子(EGF)刺激后HaCaT细胞增殖和凋亡及表皮生长因子受体(EGFR)磷酸化的影响。方法取0～50 g/L龙胆草提取物作用于EGF刺激后的HaCaT细胞24 h,噻唑蓝法检测细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western印迹法检测磷酸化EGFR。结果龙胆草提取物浓度依赖性地抑制EGF刺激后HaCaT细胞的增殖(r=-0.991,P＜0.01),促进EGF刺激后HaCaT细胞的凋亡(r=0.996,P＜0.05)。同时,龙胆草提取物使EGF刺激后的HaCaT细胞EGFR的磷酸化水平降低,该作用随着药物浓度的增加而增加。结论龙胆草可能通过降低EGFR的磷酸化,阻断相关细胞内信号通路来抑制角质形成细胞的过度增殖并促进细胞的凋亡。

龙胆属;角蛋白细胞;细胞增殖;细胞凋亡;受体,表皮生长因子

在临床用药中观察到,以龙胆草为主药的中药复方制剂在改善银屑病红斑和鳞屑等皮损方面有效,同时有报道经典方剂龙胆泻肝汤、当归龙荟丸等对银屑病皮损的改善疗效显著［1-2］,但对其作用机理研究未见深入。本实验旨在通过观察龙胆草提取物对HaCaT细胞增殖、凋亡及表皮生长因子受体(EGFR)磷酸化的影响,探讨其治疗银屑病的作用机制。

一、材料

HaCaT细胞由浙江省中医院中心实验室保存提供,龙胆草经水煮醇沉法浓缩提取药液,调pH至7.0,质量浓度为1 g/ml,1640培养液产自美国Hylcone公司,胎牛血清产自浙江天杭生物科技有限公司,重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)产自北京Sino Biological Inc公司,磷酸化兔抗人EGFR多克隆抗体、兔抗β肌动蛋白多克隆IgG抗体及山羊抗兔IgG二抗产自美国Bioworld Technology Inc公司。

二、方法

1.细胞培养:37℃5%CO2条件下用含10%胎牛血清的1640培养液培养HaCaT细胞。

2.噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖:取对数生长期细胞,按104/孔接种于96孔平板培养24 h,换含20 μg/L EGF的培养液培养 24 h 后, 各孔分别加入 10、20、30、40、50 g/L 龙胆草提取物200 μl,每个浓度设5个复孔,同时设立空白对照组,继续培养24 h。每孔加5 g/L MTT 20 μl,继续培养4 h。离心,弃上清液,每孔加入100 μl二甲基亚砜(DMSO),振荡,酶联免疫检测仪测定各孔490 nm处吸光度值(A490)。

3.流式细胞仪检测细胞凋亡:取对数生长期细胞,105个/孔接种于6孔平板培养24 h,换含20 μg/L EGF培养液培养24 h。各孔分别加入10、30、50 g/L龙胆草提取物2 ml,设空白对照组,继续培养4 h。收集细胞,离心。弃上清液,重悬细胞于结合缓冲液500 μl,调整细胞至106/ml,每个离心管加入膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素5 μl和碘化丙锭10 μl,室温避光15 min,用流式细胞仪分析细胞凋亡。

4.Western印迹法检测细胞磷酸化EGFR:取对数生长期细胞,待细胞长满瓶底90%时,各瓶分别加入10、30、50 g/L龙胆草提取物5 ml,设空白对照组,培养24 h。20 μg/L EGF培养液作用10 min后弃上清液。每瓶加入含20%磷酸酶抑制剂的细胞裂解液150 ml,提取细胞总蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。配制8%凝胶,每孔加入30 μg蛋白样品,置电泳缓冲液中,常规电泳操作并转膜、封闭,一抗、二抗室温孵育,曝光。

5.统计学方法:应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,结果以±s表示,两组比较采用双侧t检验,数据相关性采用Pearson相关分析法,P＜0.05为差异有统计学意义。

三、结果

1.龙胆草提取物对HaCaT细胞增殖的影响:10、20、30、40、50 g/L龙胆草提取物组的A值(0.960±0.016、0.831±0.007、0.379±0.009)与空白对照组A值(1.095)相比差异均有统计学意义(t值分别为 56.97、106.10、63.61、42.28、11.39,均P＜0.05,n=8)。龙胆草提取物在0～50 g/L范围内浓度依赖性地抑制EGF刺激后HaCaT细胞的增殖,增殖率与浓度呈线性负相关(r=-0.991,P＜0.01)。

2.龙胆草提取物对EGF刺激后HaCaT细胞凋亡的影响:空白对照组及10、30、50 g/L龙胆草提取物组细胞凋亡率分别为2.1%、5.9%、20.7%、36.3%,见图1。且细胞凋亡率与龙胆草提取物浓度呈正相关(r=0.996,P＜0.05)。

图1 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

3.龙胆草提取物对HaCaT细胞EGFR磷酸化的影响:龙胆草提取物在0～50 g/L范围内,HaCaT细胞均有基础量的磷酸化EGFR,随着龙胆草提取物浓度的增加,EGFR磷酸化水平呈降低趋势。见图2。

图2 龙胆草提取物对HaCaT细胞EGFR的磷酸化的影响

四、讨论

EGFR被认为是在包括表皮角质形成细胞(KC)在内的多种细胞的增殖和凋亡过程中有着重要作用［3］。银屑病的病理基础主要在于KC增殖和凋亡异常,因此,研究增殖和凋亡及与其密切相关的细胞因子EGFR,对银屑病的发生发展和治疗转归有着重要的意义。EGFR是一种酪氨酸激酶型受体,广泛分布于哺乳动物的上皮细胞膜表面。当其与包括EGF在内的多种配体之一结合后进入细胞内,形成同源或异源二聚体,传递信号,激活相关信号通路,对细胞周期进行调控。在正常的皮肤损伤反应中,EGFR及其配体通过刺激增生和调节分化促进KC移动,参与急性伤口的愈合过程。它们持续过度的异常表达,导致细胞异常增殖、黏附,从而引起包括银屑病、特应性皮炎等在内的多种慢性炎症性皮肤病的发生［4］。EGFR在银屑病进行期、静止期皮损的基底层及棘层、颗粒层中均有较强表达,在正常皮肤和银屑病消退期的表达明显减少［5］。此外临近正常皮肤的皮损也有较强表达［6］。说明EGFR的高表达与银屑病的发生、发展关系密切［7］。阻断EGFR能显著提高KC在应激状态(如传代)时的凋亡率［8］。靛玉红治疗银屑病有效,其治疗机理为抑制EGFR的激活［9］。酪氨酸激酶抑制剂AG 1571(SU 5271)抑制EGFR的磷酸化,被认为是强有效的抗银屑病药物之一［10］。厄洛替尼(一种恶性肿瘤治疗药物)能抑制EGFR酪氨酸激酶抑制剂,有报道成功地治愈了2例肺癌合并银屑病患者的皮肤疾病［11］。

我们通过EGF刺激HaCaT细胞,使其模拟银屑病KC的异常增殖状态,并通过MTT法及流式细胞仪检测细胞的增殖及凋亡情况。结果显示,在10～50 g/L浓度范围内,龙胆草提取物能有效抑制HaCaT细胞的增殖。当浓度大于30 g/L时,抑制作用明显。其抑制作用与浓度呈线性相关。上述实验结果与流式细胞仪测得的细胞凋亡率结果相符。表明龙胆草抑制HaCaT细胞的增殖可能是通过促进细胞凋亡来完成的。进一步Western印迹法分析发现,龙胆草提取物能使EGFR的磷酸化降低,并且在0～50 g/L浓度范围内随着浓度的增加,EGFR的磷酸化水平降低。表明龙胆草提取物抑制HaCaT细胞增殖和促进凋亡的作用至少部分可能是通过降低EGFR的磷酸化从而阻断相关细胞内信号通路来实现。50 g/L与30 g/L龙胆草提取物组EGFR的磷酸化水平相当,提示EGFR的磷酸化可能存在多条通路,而龙胆草提取物仅能干预其中部分通路的表达,具体机制有待后续研究。

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Effect of Chinese gentian on the proliferation of,apoptosis and phosphorylation of epidermal growth factor receptor in HaCaT cells

Lou Yinfei，Ma Lili，Zheng Mingjing，Zhou Hui，Fang Yimiao.Department of Dermatology，First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310058，China

Ma Lili，Email:ma_lili@hotmail.com

Objective To evaluate the effect of Chinese gentian extracts on the proliferation of，apoptosis and phosphorylation of epidermal growth factor receptor(EGFR)in HaCaT cells induced by epidermal growth factor(EGF).Methods Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was performed to evaluate the proliferation of HaCaT cells pretreated with EGF of 20 μg/L for 24 hours followed by 24 hours of treatment with various concentrations of Chinese gentian extracts.Flow cytometry was carried out to detect apoptosis in HaCaT cells pretreated with EGF of 20 μg/L for 24 hours followed by 4 hours of treatment with different concentrations of Chinese gentian extracts.Western blot was conducted to measure the level of phosphorylated EGFR in HaCaT cells treated with different concentrations of Chinese gentian extracts for 24 hours followed by treatment with EGF of 20 μg/L for 10 minutes.Results Chinese gentian extracts inhibited the proliferation(r=-0.991，P＜ 0.01)，but promoted the apoptosis(r=0.996，P＜ 0.05)of HaCaT cells induced by EGF in a dose-dependent manner.At the same time，the extracts suppressed the phosphorylation of EGFR in HaCaT cells induced by EGF，and the suppressing effect increased with the rise in the concentration of the extracts.Conclusions Chinese gentian may inhibit the proliferation，but promote the apoptosis of keratinocytes by decreasing EGFR phosphorylation and blocking relevant intracellular signaling pathways.

Gentian；Keratinocytes；Cell proliferation；Apoptosis；Receptor，epidermal growth factor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.018

浙江省自然科学基金(Y2091225)

310058杭州,浙江中医药大学附属第一医院皮肤科

马丽俐,Email:ma_lili@hotmail.com

2013-10-30)

(本文编辑:尚淑贤)