非标记定量技术研究特应性皮炎患者血清的差异蛋白

刘苏俊 徐舰 赵斌 朱惠军 孙焱 徐瑾 沈宏

非标记定量技术研究特应性皮炎患者血清的差异蛋白

刘苏俊 徐舰 赵斌 朱惠军 孙焱 徐瑾 沈宏

目的应用非标记定量技术研究特应性皮炎患者血清中的差异表达蛋白,筛选特异性蛋白质标记物。方法收集特应性皮炎患者和健康对照者的血清各6份,处理和提取血清蛋白质,经一维SDS-PAGE和蛋白胶内酶解获得肽段,应用高效液相色谱串联质谱鉴定,使用Mascot软件查询并用Scaffold软件作相对定量分析。结果特应性皮炎患者组和健康对照组的血清共检测出76种差异表达超过1.5倍的蛋白质,患者组血清表达上调的有50种蛋白质,表达下调的有26种蛋白质,其中有26种蛋白质仅在患者组表达,14种蛋白质仅在对照组表达。结论特应性皮炎患者与健康人血清间存在蛋白质表达差异。

皮炎,特应性;蛋白质组学

蛋白质组学技术是一种近年来常用的一种发现疾病特异性分子的检测方法,常用的有基于二维凝胶电泳的蛋白质组学分析(2D-DIGE)等,该方法存在一些局限性,分辨率不够高,样本需要量多且操作较复杂［1］。本文拟通过非标记(label-free)定量蛋白质组技术这一较新的高通量检测方法对特应性皮炎患者血清进行检测,以期发现一些新的特异性蛋白,为进一步深入研究特应性皮炎的发病机制等提供一定的依据。

一、对象

6例特应性皮炎患者为我院门诊或住院患者,男女各3例,年龄4～11岁,根据Hanifin-Rajka诊断标准确诊为特应性皮炎,SCORAD评分介于51～72分之间。对照血清来自年龄和性别匹配的6位健康自愿者,无特应性疾病史,目前未患其他疾病。所有血清采集均经过受采者监护人知情同意。患者组及对照组均于清晨空腹采集肘静脉血3 ml,置于干燥、无抗凝剂的离心管内,4℃静置2 h,4℃1 200×g离心10 min,分装200 μl血清并于-80℃低温保存。

二、主要试剂和仪器

Proteominer试剂盒(美国Bio-Rad公司),Bradford定量试剂盒(美国Bio-Rad公司),测序级胰蛋白酶(美国Promega公司),色谱纯乙腈(德国MERCK公司),甲叉丙烯酰胺、碘乙酰胺和色谱纯甲酸(美国FLUKA公司),IPGphor等电聚焦仪(美国Amersham公司),Etan Daltsix电泳仪(美国Amersham公司),Imagescanner凝胶成像仪(美国Amersham公司),Image-Master凝胶分析软件(美国Amersham公司),激光显微切割仪(美国Arcturus公司),反相液相色谱柱(美国Michrom公司),质谱仪LTQ-Orbitrap(美国热电公司),纳升级高效液相色谱仪 LC-20AD及微量自动进样器SIL-20AC(日本岛津公司)。

三、方法

1.蛋白处理:血清样品置冰上室温溶解。从患者组和对照组每组的6个血清标本中各取100 μl混合,形成两个组各600 μl混合血清。严格按照Proteominer试剂盒使用说明书进行实验操作,以去除高丰度蛋白质。用改良的Bradford法测定收集蛋白样品中的蛋白质浓度。

2.一维SDS-PAGE:用7 cm的12%小胶电泳2 h,考马斯亮蓝染色并脱色过夜后,出现清晰的蛋白条带。

3.蛋白胶内酶解:将蛋白条带从凝胶切下,切碎后(约1 mm×1 mm)置于96孔板中。加入200 μl 100 mmol/L碳酸氢铵溶液/50%乙腈脱去考马斯亮蓝染料。用200 μl乙腈将凝胶脱水至白色颗粒状。加入12.5 mg/L胰蛋白酶溶液覆盖凝胶颗粒,4℃放置30 min,使凝胶完全泡胀。加25 μl 25 mmol/L碳酸氢铵溶液覆盖胶粒,置于37℃控温摇床内16 h。取出冷却至室温后加入3 μl甲酸终止反应。用50 μl 0.1%三氟乙酸(TFA)/50%乙腈提取2次,每次超声5 min,合并2次提取液。用Speed-vac真空浓缩后,每样品用20 μl水/0.1%甲酸溶解。

4.液相色谱分离:反相液相色谱柱的反相柱为75 μm×15 cm(Magic AQ C18 填料,3.5 μm 粒径,2 000 Å 孔径),流动相A水/0.1%甲酸,B乙腈/0.1%甲酸,流速300 nl/min。梯度程序:0～5 min,B相为2%;5～95 min,B相由5%升至35%;95～96 min,B相升至90%;96-101 min,保持90%;101～103 min,B相由90%降为2%,103～120 min,保持2%。样品以9 600×g离心10 min后放入进样瓶中,由仪器自动进样15 μl。设定批处理程序,经高效液相色谱分离直接通过纳电喷雾接口进入自动串级质谱分析(Auto-MS/MS)。

5.LTQ-Orbitrap的参数设置:电喷雾电压1 800 V;MS扫描范围350～1 800 Da;每次扫描选择10个强度最高的母离子进行MS/MS扫描。实验部分于复旦大学生物医学研究院指导完成。

6.数据库搜索:通过Mascot软件2.3版本进行查询,ESI所得结果用MSConverter(Proteowizard平台,华盛顿州大学,美国)进行格式转换为mgf文件。搜索参数设置:数据库为瑞士 SWISSPROT;检索种属为人,Homo Sapiens［human］;母离子质量偏差容忍度25 ppm,碎片质量偏差容忍度0.6 Da;最大允许漏切位点为2;酶为胰蛋白酶;甲硫氨酸氧化和蛋白质N端乙酰化为可变修饰。用Scaffold(3.4.3版本,Proteome Software公司,美国)软件计算搜库结果的置信度,肽段和蛋白的置信度是通过PeptideProphet和ProteinProphet(系统生物学研究所,美国)算法分别计算。通过选择置信度高于90%为接受标准,最终结果的假阳性率小于5%。

7.相对定量分析:Scaffold软件同时也用于相对定量分析,对于每一张得到鉴定的谱图都把置信度纳入考虑后,计算得到每一个蛋白的定量值。定量方法是经过修改的谱图计数法。

表1 特应性皮炎患者和对照血清中差异大于2倍的蛋白质

四、结果

患者组及对照组样品分别进行3次重复实验,实验结果具有高度的相似性。选择3次重复实验中均鉴定到的蛋白质做进一步的差异倍数统计分析。以差异倍数大于1.5倍作为参考标准筛选差异表达蛋白质。本研究中,特应性皮炎患者组和健康对照组的血清共检测出181种蛋白质,其中患者组167种,对照组155种,两者共有蛋白质为141种。患者组高表达的有50种蛋白质,低表达的有26种蛋白质,其中有26种蛋白质仅在患者组表达,14种蛋白质仅在对照组表达。表1列出差异大于2倍及仅在对照组或者患者组出现的差异蛋白质。差异大于1.5倍而小于2倍的比较重要的蛋白还有细胞外超氧化物歧化酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、补体因子B、视黄醇结合蛋白4、血清淀粉样蛋白A1、α1抗糜蛋白酶和基膜聚糖等。

五、讨论

定量蛋白质组学可以精确测量多个不同生理或病理条件下生物样本中蛋白质表达量的变化［2］。非标记定量是其中一种较为常用的研究方法,一般多为相对定量,实验操作简单,对样本的操作少,在检测肽段的数量、蛋白质的覆盖率和分析通量方面具有较大优势,但在进行相对定量时,低丰度蛋白不易检测。

蛋白质组学常用于肿瘤类疾病中某些标志物的检测。国内已有学者在瘢痕疙瘩［3］和银屑病［4］等皮肤病的研究中,应用蛋白质组学技术发现了疾病的某些特异性蛋白。

本文应用非标记定量技术对特应性皮炎患者和健康对照血清进行比较蛋白组学研究,检测到了76种明显差异表达的蛋白。患者组高表达的有50种蛋白质,其中26种仅在患者组表达。对照组高表达的有26种蛋白质,有14种仅在对照组表达。本研究中发现的样本总蛋白数量比较少,可能与样本处理和蛋白提取等过程中部分蛋白丢失有关,这需要在以后研究中改进实验方法。

研究中发现的差异蛋白主要与免疫、炎症、感染及增殖和分化等有关,现对其中一些蛋白进行初步讨论,这些蛋白将作为我们后续研究的重点。

细胞外超氧化物歧化酶(extracellular superoxide dismutase,EC-SOD)不仅能清除超氧化物,保护组织免受炎症损伤,而且还可以在免疫反应过程和信号启动中有重要的调节作用［5］。本研究结果中患者血清中EC-SOD较健康对照组明显下降,提示EC-SOD下降可能与特应性皮炎患者明显的炎症反应有关。

弹性蛋白结合蛋白(Ficolin-2)是由肝脏合成并分泌至血液中,能够激活补体的凝集素途径［6］,在针对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、沙门菌等细菌的天然免疫中有重要作用。Cedzynski等［7］在儿童患者中发现血清Ficolin-2的下降与合并过敏性疾病的呼吸道感染有关,且与过敏的关系比感染的关系更密切。本研究发现,特应性皮炎患者血清中的Ficolin-2水平较健康对照明显下降。特应性皮炎患者皮损表面常出现的金黄色葡萄球菌定植或感染,可显著加重特应性皮炎的病情,这是否与其血清中的Ficolin-2水平下降有关值得进一步研究。

有研究发现,腱糖蛋白(Tenascin)基因［8］和蛋白［9］在特应性皮炎皮损的表达明显升高。本研究发现,其在血清中亦明显升高,提示腱糖蛋白在特应性皮炎的发病中有一定作用。

单核细胞分化抗原(CD14)的159C/T基因多态性与特应性哮喘的易感性有关［10］,CD14-159 C/T基因型的血清可溶性CD14水平升高［11］。本研究中特应性皮炎患者血清的可溶性CD14水平显著升高,可能与特应性皮炎的发病有相关性。

在本研究检测到的特应性皮炎患者血清比健康对照高表达的52种蛋白中,有很多蛋白是与细菌感染和炎症等有关,如N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、补体因子B、视黄醇结合蛋白4等。还有些蛋白如角蛋白1、角蛋白2、角蛋白9、角蛋白10以及角质形成细胞分化相关蛋白与维持皮肤角质层的完整性有关。

2008年有学者对特应性皮炎患者血浆中糖蛋白用2DDIGE方法进行蛋白质组学研究［12］,发现16种蛋白在特应性皮炎中表达上调或下调。其中,有2个蛋白在本研究中也被发现。血红素结合蛋白在特应性皮炎血浆表达下调,与本研究一致。纤维蛋白原γ链在上述研究中为血浆低表达,而本研究中为血清高表达,可能与血浆和血清标本不同及检测方法不同等因素有关。

我们应用非标记定量技术研究了特应性皮炎患者血清的蛋白质组,得到一些差异表达蛋白。这些差异蛋白还需要在大样本量的研究证实。

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Application of label-free quantitative proteomics in the screening for differentially expressed serum proteins in patients with atopic dermatitis

Liu Sujun，Xu Jian，Zhao Bin，Zhu Huijun，Sun Yan，Xu Jin，Shen Hong.Department of Dermatology，Third People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Shen Hong，Email:shenhangzhou@sina.com

Objective To screen differentially expressed serum proteins by label-free quantitative proteomics in patients with atopic dermatitis，in order to discover serum protein markers for atopic dermatitis.Methods Serum samples were collected from 6 patients with atopic dermatitis and 6 healthy human controls.Then，the samples from the patients were pooled together，so with those from the controls.Proteins were extracted from the two joint serum samples followed by separation with one-dimensional sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis(SDS-PAGE).Peptides were obtained by enzymolysis in protein gels，which were subsequently identified by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.The Mascot software was used for database searching，and the Scaffold software for relatively quantitative analysis of proteins.Results Totally，76 proteins with a difference of greater than 1.5 folds were identified between the serum samples of patients with atopic dermatitis and controls.There were 50 up-regulated and 26 down-regulated serum proteins in the patients compared with the healthy controls.Among these differentially expressed proteins，26 were only detected in the sera of the patients，and 14 proteins in those of the controls.Conlusion Differences exist in the expression of serum proteins between atopic dermatitis patients and healthy people.

Dermatitis，atopic；Proteomics

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.016

浙江省自然科学基金(Y2091229)

310009杭州市第三人民医院皮肤科

沈宏,Email:shenhangzhou@sina.com

2013-12-23)

(本文编辑:颜艳)