纤溶酶原激活物抑制剂-1基因启动子区4G／5G多态性与胃癌侵袭和转移的关系

蔡 芬，曾小菁（广东省广州市中西医结合医院检验科 510800）

目前相关研究认为恶性肿瘤侵袭转移与纤溶活力密切相关［1-2］。纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）具有多种生物学功能，参与细胞的迁移、黏附及侵袭过程，人类PAI-1基因定位于7q21.3-7q22，PAI-1基因有8处不同的多态位点。4G／5G缺失／插入多态性是指在PAI-1基因5′端启动子区域，转录起始位点上游-675bp处存在一种单核苷酸G插入或缺失，从而基因型表现为3种多态性：4G／4G、4G／5G、5G／5G，在调节PAI-1基因表达过程中起了重要作用。既往研究多关注PAI-1在某种肿瘤的变化，而很少涉及PAI-1基因多态性在肿瘤转移和侵袭中的作用。本研究分析胃癌患者癌变胃组织和癌旁正常胃组织PAI-1基因启动子区4G／5G基因分布频率，分析以上各项指标与胃癌侵袭和转移的关系，为临床判断预后、指导治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料随机选取2009年4月至2010年2月本院胃肠外科初诊为胃癌拟手术治疗的患者28例，其中男12例，女16例，年龄26～79岁。临床病理分期［国际抗癌联盟（UICC）2005年公布的胃癌TNM分期法］：其中Ⅰ期4例，Ⅱ期6例，Ⅲ期16例，Ⅳ期2例；有淋巴结转移19例，其中Ⅱ期2例，Ⅲ期15例，Ⅳ期2例；无淋巴结转移9例。以上患者术前均未接受放化疗，所有病例经手术治疗后病理组织均经病理检查证实［3］。

1.2 主要仪器与试剂聚合酶链反应（PCR）仪（美国Sigma公司），电泳仪（AE-8130，日本ATTO公司），凝胶成像系统（UVP Mini，美国UVP公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 切取患者癌变胃组织和癌旁正常胃组织（距离癌变组织至少20cm以上）各约1cm×1cm冰冻保存。1.3.2 组织标本DNA提取 将组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5mL离心管中，剪碎，盐析法提取组织白细胞DNA，-20℃保存。

1.3.3 PCR引物合成 PCR扩增引物设计参照文献［4］。P1（插入型5G）：5′-GTC TGG ACA CG TGG GGG-3′，产物大小140bp；P2（缺失型4G）：5′-GTC TGG ACA CGT GGG GA-3′，产物大小139bp；P3：5′-TGC AGC CAG CCA CGT GAT TGT CTA-3′。

1.3.4 PAI-1基因的PCR扩增 每份DNA标本同时进行两个体系PCR反应，即P1P3和P2P3反应体系。总反应体系25 μL，首先94℃预变性5min；94℃45s，62℃45s，72℃1min，30个循环；72℃延伸7min。

1.3.5 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 吸取10μL PCR产物与2μL 10倍上样缓冲液吹打混匀，上样至20g／L琼脂糖凝胶梳孔中，150V稳压电泳40min，根据电泳图形鉴别基因型。在凝胶成像系统中成像、摄片，并判断各样本的基因型结果。

1.4 统计学处理采用SPSS11.5医学处理软件进行统计学分析。采用基因计数法计算各组基因型频率，χ2检验比较两组标本各基因型的分布差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PAI-1 4G／5G基因型分布特征胃癌患者癌变胃组织和癌旁正常胃组织基因型分布在总体研究对象中经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡，根据χ2值查χ2界值表得出相应的P值。可以鉴别出3种基因型：4G／4G型只有139bp片段，4G／5G型有139bp和140bp 2个片段，5G／5G型只有140bp片段。见图1。

图1 PCR产物电泳图片

2.2 胃癌患者PAI-1 3种基因型在癌变胃组织和癌旁正常胃组织的表达差异无统计学意义（χ2=2.120，P＞0.05），见表1。

表1 胃癌患者不同胃组织基因型分布与比较［n（%）］

2.3 PAI-1三种基因型在胃癌各期表达差异无统计学意义（χ2=1.431，P＞0.05），见表2。

表2 胃癌组织分期与PAI-1 4G／5G基因型的分布（n）

2.4 胃癌淋巴结转移与PAI-1 3种基因型分布频率差异有统计学意义（P＜0.05），且4G／4G型可能是胃癌淋巴结转移的风险因素，见表3。

表3 胃癌淋巴结转移与PAI-1 4G／5G基因型的关系［n（%）］

3 讨 论

近年来，PAI-1基因多态性在肿瘤生长中所起的作用成为研究热点。Gilabert-Estellés等［5］发现，PAI-1基因4G／5G分布频率较健康人群高，且4G／4G基因型可能是子宫内膜癌发生的风险因素。Lei等［6］发现，PAI-1 4G／5G插入／缺失多态性与乳腺癌的不良预后相关，其中5G／5G基因型乳腺癌患者预后最差，5G／5G基因型与乳腺癌淋巴结转移相关。Lee等［7］发现，PAI-1 4G／5G插入／缺失多态性与乳腺癌的病理学分期和预后相关，且4G／4G基因型可能是乳腺癌发生的风险因素，5G／5G基因型与乳腺癌淋巴结转移相关。本研究结果表明，PAI-1 4G／5G插入／缺失多态性与胃癌的侵袭、TNM分期无关，而与胃癌淋巴结转移相关，且4G／4G型基因可能是胃癌淋巴结转移的风险因素。体外实验分析发现，PAI-1基因启动子活性在某些细胞因子刺激下4G等位基因比5G等位基因具有更高的转录活性；研究者认为是由于4G等位基因只结合了一种转录激活物，而5G等位基因除了结合了这种转录激活物外，还在相同位点结合了一种转录抑制物，所以5G等位基因较4G等位基因的PAI-1转录活性低［8］。PAI-1基因4G／5G多态性的测定有助于胃癌患者病情判断、临床用药的选择、复发可能性的观测和预后的判断等。

［1］王肖泽，王继见.胃癌转移机制研究新进展［J］.重庆医学，2010，39（4）：479-481.

［2］Hildenbrand R，Allgayer H，Marx A，et al.Modulators of the urokinase-type plasminogen activation system for cancer［J］.Expert Opin Investig Drugs，2010，19（5）：641-652.

［3］吴在德，吴肇汉.外科学［M］.7版.北京：人民卫生出版社，1984：437-441.

［4］Nagi DK，McCormack LJ，Mohamed-Ali V，et al.Diabetic retinopathy，promoter（4G／5G）polymorphism of PAI-1 gene，and PAI-1activity in Pima Indians with type 2diabetes［J］.Diabetes Care，1997，20（8）：1304-1309.

［5］Gilabert-Estellés G，Labraza-Boéls J，Agilabert J，et al.Plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）4G／5Gpolymorphism and endometrial Cancer［J］.Thromb Res，2012，130（2）：242-247.

［6］Lei H，Hemminki K，Johansson R，et al.PAI-1-675 4G／5G polymorphism as a prognostic biomarker in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2008，109（1）：165-175.

［7］Lee JH，Kim Y，Choi JW，et al.Clinicopathological significance of plasminogen activator inhibitor-1promoter 4G／5Gpolymorphism in breast Cancer：a meta-analysis［J］.Arch Med Res，2013，44（1）：39-45.

［8］Ho CH，Yuan CC，Liu SM.Diagnostic and prognostic values of plasma levels of fibrinolytic markers in ovarian cancer［J］.Gynecol Oncol，1999，75（3）：397-400.