人脐带间充质干细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验模型研究

延安大学医学院（延安716000） 韩继明 杨 玲 王 璐 朱文侠 阮彩莲

目前临床上长距离的神经缺损修复一般采用自体神经桥接术，但自体神经的来源有限，因此取材方便、无排斥反应的神经便成为外周神经修复研究的热点。近年来具有多向分化潜能的人脐带间充质干细胞（Human Umbilical Cord Blood Derived Mesenchymal Stem Cells，HUMSC）受到学者的关注，体外实验证实其可以分化为神经细胞［1］。笔者对坐骨神经缺损套管模型鼠注入HUMSC悬液，大鼠坐骨神经损伤得到一定程度的修复，现报告如下。

材料和方法

1 材料选择 60只成年健康SD大鼠，雌雄各半，体重200±20g。人羊膜取自健康、足月、顺产的胎儿胎盘。使用DF12培养基培养纯化的HUMSC，传代过程中使用胰蛋白酶消化。使用日本光电MEB－9200K诱发电位／肌电图测量系统检测神经电生理活动。

2 方 法

2．1 人羊膜的制备：超净台内从胎盘上分离出羊膜，用0．1%NH4OH处理羊膜后剪成2．0cm×2．5cm小块，放入500ml无菌PBS中，－20℃储存备用。室温融化后使用。

2．2 人脐带间充质干细胞纯化传代培养：纯化的HUMSC传代过程：PBS清洗，加胰蛋白酶消化2～3min，加培养基终止消化，1000r／min离心4min，加培养基重悬，传至新的培养液。传代至3～4代后，配制1×106个细胞／ml的细胞悬液备用［2］。

2．3 坐骨神经缺损套管模型鼠的制备和处理：所有大鼠经乌拉坦麻醉后，对预手术部位进行消毒。股后部作斜行25mm的切口，钝性分离，暴露、游离坐骨神经，将制备好的羊膜于梨状肌下缘5mm处搭在坐骨神经上，缝合两端神经外膜和羊膜，切除6～8mm的坐骨神经，使其自然回缩后达10mm的间隙即可。间隙和羊膜形成一段羊膜腔。60只坐骨神经缺损套管模型鼠随机分为三组：空白对照组、实验组、标准对照组。A组大鼠不采取其他措施，B组大鼠羊膜腔内注入HUMSC悬液，C组大鼠实施自体坐骨神经桥接术。观察记录大鼠一般的身体状态。12周后，使用日本光电MEB－9200K诱发电位／肌电图测量系统检测神经电生理活动；取双侧腓肠肌，使用分析天平对其湿重进行称量［3］。

3 统计学方法 所有数据录入SPSS 17．0软件中处理，使用±s表示计量资料，t检验进行组间比较，P＜0．05表示有统计学意义。

结 果

术后12周两组大鼠神经电生理检测结果见表1、2。

表1 12周后各组大鼠腓肠肌湿重比较（±s）

表1 12周后各组大鼠腓肠肌湿重比较（±s）

注：与空白对照组比较，＊P＜0．05

组 别 术侧湿重（g） 健侧湿重（g） 术侧湿重／健侧湿重（%）A组0．37±0．04 1．58±0．08 29．20±0．46 B组 0．40±0．03 1．61±0．06 43．86±0．51＊C组 0．53±0．06 1．62±0．06 55．64±0．42＊

表2 12周后两组大鼠神经电生理检测结果（±s）

表2 12周后两组大鼠神经电生理检测结果（±s）

注：与标准对照组比较，＊P＜0．05

组 别 潜伏期（ms） 传导速度（m／s） 波幅（mV）2．56±0．40 12．38±0．38 4．01±0．32 C组 2．49±0．51 13．72±0．41 4．25±0．43 P值 ＞0．05 ＞0．05 ＞B组0．05

讨 论

HUMSC能进行多向分化，增值能力强。分娩后的新鲜人脐带内含有大量的HUMSC，取材方便，不存在伦理和法律的约束；HUMSC不引起排斥反应，主要是因为其对 HLA－DR、CD80、CD40不表达，无 HLA抗原，不能引起T细胞活化［4］。新鲜的胎盘在母体内有胎盘屏障的保护，细菌、病毒污染的概率极低。同时高增殖性、低免疫原性等特点使HUMSC成为治疗外周神经损伤替代疗法的研究热点［5］。

本研究中使用人羊膜构建的羊膜腔含有多种可以促进损伤的细胞再生和HUMSC转化为神经细胞的物质。羊膜内含有大量的糖蛋白和硫酸乙酞肝素等，无细胞成分，自身免疫性很低。其含有的多种物质为再生的神经轴索提供基架，引导神经生长［6］。

实验中各组大鼠术后术侧腓肠肌都出现不同程度的萎缩，是因为神经受损后，肌肉生长依赖的神经末梢释放的某些营养物质分泌缺乏。B组和C组大鼠的术侧湿重／健侧湿重比值和A组比较，具有统计学意义（P＜0．05），实验组的各神经电生理指标和标准对照组比较，潜伏期长，传导速度慢，波幅小，但无统计学差异（P＞0．05），说明HUMSC抑制了肌肉萎缩，促进神经细胞再生，分化为神经细胞使神经电生理得到恢复。神经传导性的有无是评价神经功能的一项关键指标，传导速度的快慢、波幅的大小可以辅助判断神经恢复的程度［7］。

HUMSC修复大鼠坐骨神经损伤的确切机制还不明了，推测与以下机制有关：①在体内微环境的影响下替代神经元，桥接断端，使神经恢复功能；②改善神经损伤引起的水肿，炎症反应；③能促进神经元合成代谢，增加蛋白质的合成；④合成和分泌某些营养因子，促进神经元的生长，防止肌肉萎缩［8］。

［1］ 张彩顺，吕 刚，张基仁，等．无细胞神经移植物复合骨髓间充质干细胞修复大鼠坐骨神经缺损［J］．中国组织工程研究与临床康复，2009，13（28）：5429－5432．

［2］ 单 伟，王长辉，秦书俭，等．人脐带间充质干细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究［J］．中国医科大学学报，2011，40（8）：696－698．

［3］ 柳 菁，许 超，宇 丽，等．两种培养体系条件下人脐带间充质干细胞向软骨细胞的分化［J］．中国组织工程研究，2012，16（41）：7625－7630．

［4］ 张芬熙，洪 艳，梁文妹．人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究［J］．贵阳医学院学报，2013，38（1）：5－9．

［5］ 赵玉金，李瑶琛，赖洁娟，等．大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件的优化及生物学特性［J］．第三军医大学学报，2010，32（20）：2163－2167．

［6］ Mi－Ae S，Jong JH，Jung－Woo L，et al．Human umbilical cord blood－derived mesenchymal stem cells promote regeneration of crush－injured rat sciatic nerves［J］，Neural Regeneration Research，2012，7（26）：2018－2027．

［7］ 易 智，刘时璋，史 军，等．人源性脐带间充质干细胞移植治疗骨关节炎的实验研究［J］．陕西医学杂志，2012，42（10）：1308－1309．

［8］ 刘时璋，凌 鸣，易 智，等．间充质干细胞在兔骨关节炎关节腔内移植的研究［J］．陕西医学杂志，2013，42（11）：1450－1452．